A multistep approach to characterize a collection of endophytic bacteria with bioprotective potential: from molecular typing to postharvest application

Microbial biocontrol is a biological strategy receiving increasing interest as a sustainable innovation, useful for managing diseases and spoilage arising from undesired microbial contaminations in foodstuff [1]. The work hereby presented was carried out within a research project focusing on the exploration of the bio-protective potential of some bacterial isolates, mainly wood-endophytic Actinobacteria, against Botrytis cinerea, in the context of post-harvest biocontrol on fruits. For this purpose, the identification, characterization, and proper description of the recovered microbial species is also essential. Therefore, the first step of this work has been the setup of a tailored method, combining 16S rDNA sequencing and Rep-PCR [2,3], to ascertain the isolates differentiation and their identification at genus level or below. More than one hundred isolates were recovered from wood and roots of different grapevine genotypes and were cultured using appropriate growth media, then subjected to the settled multistep molecular identification, obtaining a good dereplication for endophytic bacteria, together with a reliable genetic identification (more than 70% reaching the species level), both essential preconditions to make a correct assessment of bio-protection. Afterwards, the bio-protective potential of the most promising bacterial isolates, previously screened through in vitro assays [4], was tested in post-harvest condition on grape berries and compared with the performance of a reference oenological strain of Metschnikowia fructicola [5]. Initial trials under controlled conditions (lab-scale treatment of table grape and controlled Botrytis infections) allowed to evaluate the ability of bacterial strains to colonize the habitat and survive during storage, important feature to act as potential BCAs (Biological control agents). Further trials under industrial conditions (withering warehouses for passito wine production) are in place to select the best bacterial strains and application conditions to lower fungal infections during withering. Sellitto, V.M.; Zara, S.; Fracchetti, F.; Capozzi, V.; Nardi, T. Microbial Biocontrol as an Alternative to Synthetic Fungicides: Boundaries between Pre- and Postharvest Applications on Vegetables and Fruits. Fermentation 2021, 7, 60, doi:10.3390/fermentation7020060. Borba, M.P.; Ballarini, A.E.; Witusk, J.P.D.; Lavin, P.; Van Der Sand, S. Evaluation of BOX-PCR and REP-PCR as Molecular Typing Tools for Antarctic Streptomyces. Curr. Microbiol. 2020, 77, 3573–3581, doi:10.1007/s00284-020-02199-6. Weisburg, W.G.; Barns, S.M.; Pelletier, D.A.; Lane, D.J. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. J. Bacteriol. 1991, 173, 697–703, doi:10.1128/jb.173.2.697-703.1991. Sandrini, M.; Nerva, L.; Moffa, L.; Giudice, G.; Favaretto, F.; Chitarra, W. Actinomycetes Come to Rescue of Viticulture Sustainability. In Proceedings of the Convegno AISSA# under40; Sassari, 2021; Vol. Poster. Torriani, S.; Tornielli, G. Metschnikowia Fructicola, Un Lievito Contro La Botrite. Vite&Vino 2, 38.

Il biocontrollo microbico è una strategia biologica che sta riscuotendo un crescente interesse come innovazione sostenibile, utile per la gestione di fitopatologie e deterioramenti derivanti da contaminazioni microbiche indesiderate negli alimenti [1]. Il lavoro qui presentato è stato svolto nell'ambito di un progetto di ricerca incentrato sull'esplorazione del potenziale bio-protettivo di alcuni isolati batterici, principalmente Actinobacteria endofiti del legno di vite, contro Botrytis cinerea, nel contesto del biocontrollo post-raccolta sui frutti. A tal fine, è essenziale anche l'identificazione, la caratterizzazione e la corretta descrizione delle specie microbiche isolate. Il primo passo di questo lavoro è stato infatti l'impostazione di un metodo su misura, che combini il sequenziamento del rDNA 16S e la Rep-PCR [2,3], per differenziare geneticamente gli isolati e determinarne l’identificazione a livello di genere o inferiore. Più di cento isolati sono stati recuperati da legno di diverse varietà di vite e coltivati utilizzando terreni di crescita appropriati, quindi sottoposti all'identificazione molecolare multistep precedentemente ottimizzata, dimostrando come un approccio polifasico possa essere utile per la corretta caratterizzazione della nostra collezione. In questo modo, siamo riusciti ad ottenere una buona dereplication per i batteri endofiti, insieme ad una robusta identificazione genetica (oltre il 70% raggiunge il livello di specie), entrambi presupposti essenziali per fare una corretta valutazione della bioprotezione. Parallelamente, il potenziale bio-protettivo degli isolati batterici più promettenti, precedentemente sottoposti a screening mediante saggi in vitro [4], è stato testato in condizioni post-raccolta su grappoli d'uva e confrontato con le prestazioni di un ceppo commerciale di riferimento di Metschnikowia fructicola [5]. Le prove iniziali in ambiente controllato (trattamento su scala di laboratorio di uva da tavola con infezioni controllate di Botrytis) consentono di valutare la capacità dei ceppi batterici di colonizzare l'habitat e sopravvivere durante lo stoccaggio, caratteristica importante per agire come potenziali agenti di biocontrollo. Ulteriori prove in condizioni industriali (fruttai di appassimento) sono in atto per selezionare i migliori ceppi batterici e le condizioni di applicazione più indicate per ridurre al meglio le infezioni fungine durante l'appassimento.