Con genome editing s’intende l’introduzione di una modifica in un punto preciso del genoma della cellula attraverso l’utilizzo di nucleasi artificiali che operano sul gene bersaglio una rottura, la cui riparazione può generare mutazioni ed annullare la funzione del gene. Il sistema più diffuso è quello CRISPR/Cas9 di Streptococcus pyogenes, e prevede che una DNA nucleasi (Cas9) venga guidata ad una sequenza di DNA da modificare, grazie alla sua associazione con una piccola molecola di RNA (RNA guida) in grado di appaiarsi alla sequenza bersaglio. L’allegagione, l’inizio della crescita dell’ovario a seguito della fecondazione, è un processo coordinato da segnali endogeni, soprattutto ormonali, ma che risente di fattori ambientali, che se sfavorevoli, possono avere effetti negativi sulla fecondazione e sulla produttività. Numerosi geni che controllano l’allegagione sono stati individuati. La partenocarpia è un processo alternativo in cui lo sviluppo del frutto avviene in assenza di fecondazione ed indipendentemente dalle condizioni ambientali. La manipolazione genetica del metabolismo e della trasduzione del segnale dell’auxina e delle gibberelline ha permesso di identificare i geni che controllano la partenocarpia. Nel presente studio, il sistema CRISPR è stato usato per indurre mutazioni nel gene SlARF7, noto per essere un regolatore dello sviluppo partenocarpico del frutto di pomodoro. Tre sequenze nucleotidiche corrispondenti a 3 RNA guida aventi come bersaglio 3 regioni diverse del gene SlARF7 sono state clonate nel T-DNA di un vettore binario pFGC-pcoCAS9 (https://www.addgene.org; Li et al., 2013). L’efficacia dei tre RNA del costrutto nell’indurre il taglio nel gene ARF7- RNA guida mediato, è stata testata in vitro attraverso l’impiego del kit commerciale “Guide-it sgRNA in vitro Transcription and Screening Systems” (Clontech). Il vettore binario è stato poi inserito in Agrobacterium tumefaciens (ceppo GV2260) ed impiegato per indurre mutazioni nella cv. UC82
Utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ottenere partenocarpia in pomodoro
Molesini B.;Pandolfini T.;
2018-01-01
Abstract
Con genome editing s’intende l’introduzione di una modifica in un punto preciso del genoma della cellula attraverso l’utilizzo di nucleasi artificiali che operano sul gene bersaglio una rottura, la cui riparazione può generare mutazioni ed annullare la funzione del gene. Il sistema più diffuso è quello CRISPR/Cas9 di Streptococcus pyogenes, e prevede che una DNA nucleasi (Cas9) venga guidata ad una sequenza di DNA da modificare, grazie alla sua associazione con una piccola molecola di RNA (RNA guida) in grado di appaiarsi alla sequenza bersaglio. L’allegagione, l’inizio della crescita dell’ovario a seguito della fecondazione, è un processo coordinato da segnali endogeni, soprattutto ormonali, ma che risente di fattori ambientali, che se sfavorevoli, possono avere effetti negativi sulla fecondazione e sulla produttività. Numerosi geni che controllano l’allegagione sono stati individuati. La partenocarpia è un processo alternativo in cui lo sviluppo del frutto avviene in assenza di fecondazione ed indipendentemente dalle condizioni ambientali. La manipolazione genetica del metabolismo e della trasduzione del segnale dell’auxina e delle gibberelline ha permesso di identificare i geni che controllano la partenocarpia. Nel presente studio, il sistema CRISPR è stato usato per indurre mutazioni nel gene SlARF7, noto per essere un regolatore dello sviluppo partenocarpico del frutto di pomodoro. Tre sequenze nucleotidiche corrispondenti a 3 RNA guida aventi come bersaglio 3 regioni diverse del gene SlARF7 sono state clonate nel T-DNA di un vettore binario pFGC-pcoCAS9 (https://www.addgene.org; Li et al., 2013). L’efficacia dei tre RNA del costrutto nell’indurre il taglio nel gene ARF7- RNA guida mediato, è stata testata in vitro attraverso l’impiego del kit commerciale “Guide-it sgRNA in vitro Transcription and Screening Systems” (Clontech). Il vettore binario è stato poi inserito in Agrobacterium tumefaciens (ceppo GV2260) ed impiegato per indurre mutazioni nella cv. UC82
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