Le piante sono in grado di produrre un vasto e diverso assortimento di metaboliti secondari a seguito di stress biotici e abiotici, ma le precise funzioni in vivo di queste molecole non sono ancora state delucidate. Una possibile strategia per chiarire il ruolo di specifici metaboliti secondari consiste nel modulare il profilo metabolico di linee cellulari in vitro e valutarne l’effetto sulla risposta a stress. La coltura cellulare di Daucus carota R3M, una linea pigmentata selezionata nel nostro laboratorio, presenta un caratteristico profilo metabolico ricco di antocianine e derivati degli acidi idrossicinnamici. Mediante somministrazione di precursori e/o inibitori della via metabolica dei fenilpropanoidi, si è modificato il livello di specifici metaboliti secondari nelle cellule, verificando l’effetto dei trattamenti mediante analisi metabolomica degli estratti metabolici attraverso HPLC-DAD e HPLC-ESI-MS/MS. Come stress abiotico si è utilizzato uno stress termico di 1h a 44°C. L’effetto di tale stress è stato valutato dal punto di vista citologico, mediante microscopia ottica e confocale. Dal punto di vista citologico, il trattamento termico causa gravi danni alle cellule di carota, attivando un processo di morte lenta (possibile PCD), preceduta da un rallentamento dei movimenti intracellulari, da una riarrangiamento delle briglie citoplasmatiche dall’aggregazione del citoplasma in “placche” circolari interne, simili a vacuoli autofagici, oltre a un danno ossidativo alle membrane cellulari. Al fine di verificare se danni al citoscheletro potessero essere coinvolti negli effetti citologici dello stress termico, sono state somministrate le cellule, in assenza di stress, tossine contro alcuni elementi del citoscheletro. Si è visto che la somministrazione di citocalasina D, ad opportune concentrazioni, mima l’effetto citologico dello stress termico, suggerendo che lo stress termico determini danni e microfilamenti, causando la formazione delle “placche” citoplasmatiche che anticipano la morte cellulare programmata. Si è quindi modificato il profilo metabolico delle cellule e l'effetto di queste modificazioni sulla risposta allo stress termico è stato valutato comparando la percentuale di cellule con fenotipo stressato, nei campioni sottoposti a stress termico, pre-trattati o meno che vari precursori. La somministrazione di diidroquercetina (precursore delle antocianine) ed i singoli acidi idrossicinnamici determina l’incremento dell’accumulo di specifici fenilpropanoidi, tra cui antocianine glicosilate e acilate e acidi idrossicinnamici liberi e una diminuzione del numero di cellule con fenotipo stressato. La somministrazione dell’acido piperonilico, inibitore della biosintesi dell’acido cumarico (intermedio nella biosintesi delle antocianine e substrato della loro acilazione) determina una diminuzione del livello di specifici fenilpropanoidi e un aumento del numero di cellule con fenotipo stressato. Questi dati suggeriscono che specifici fenilpropanoidi possano avere un effetto protettivo dallo stress termico, anche se l’analisi dettagliata della correlazione fra livello di metaboliti E protezione da stress è tuttora in corso.

La modificazione del profilo dei fenilpropanoidi influenza la sensibilità allo stress termico di cellule di Daucus carota

Commisso, Mauro;STRAZZER, Pamela;TOFFALI, Ketti;CEOLDO, Stefania;GUZZO, Flavia;LEVI, Marisa
2012

Abstract

Le piante sono in grado di produrre un vasto e diverso assortimento di metaboliti secondari a seguito di stress biotici e abiotici, ma le precise funzioni in vivo di queste molecole non sono ancora state delucidate. Una possibile strategia per chiarire il ruolo di specifici metaboliti secondari consiste nel modulare il profilo metabolico di linee cellulari in vitro e valutarne l’effetto sulla risposta a stress. La coltura cellulare di Daucus carota R3M, una linea pigmentata selezionata nel nostro laboratorio, presenta un caratteristico profilo metabolico ricco di antocianine e derivati degli acidi idrossicinnamici. Mediante somministrazione di precursori e/o inibitori della via metabolica dei fenilpropanoidi, si è modificato il livello di specifici metaboliti secondari nelle cellule, verificando l’effetto dei trattamenti mediante analisi metabolomica degli estratti metabolici attraverso HPLC-DAD e HPLC-ESI-MS/MS. Come stress abiotico si è utilizzato uno stress termico di 1h a 44°C. L’effetto di tale stress è stato valutato dal punto di vista citologico, mediante microscopia ottica e confocale. Dal punto di vista citologico, il trattamento termico causa gravi danni alle cellule di carota, attivando un processo di morte lenta (possibile PCD), preceduta da un rallentamento dei movimenti intracellulari, da una riarrangiamento delle briglie citoplasmatiche dall’aggregazione del citoplasma in “placche” circolari interne, simili a vacuoli autofagici, oltre a un danno ossidativo alle membrane cellulari. Al fine di verificare se danni al citoscheletro potessero essere coinvolti negli effetti citologici dello stress termico, sono state somministrate le cellule, in assenza di stress, tossine contro alcuni elementi del citoscheletro. Si è visto che la somministrazione di citocalasina D, ad opportune concentrazioni, mima l’effetto citologico dello stress termico, suggerendo che lo stress termico determini danni e microfilamenti, causando la formazione delle “placche” citoplasmatiche che anticipano la morte cellulare programmata. Si è quindi modificato il profilo metabolico delle cellule e l'effetto di queste modificazioni sulla risposta allo stress termico è stato valutato comparando la percentuale di cellule con fenotipo stressato, nei campioni sottoposti a stress termico, pre-trattati o meno che vari precursori. La somministrazione di diidroquercetina (precursore delle antocianine) ed i singoli acidi idrossicinnamici determina l’incremento dell’accumulo di specifici fenilpropanoidi, tra cui antocianine glicosilate e acilate e acidi idrossicinnamici liberi e una diminuzione del numero di cellule con fenotipo stressato. La somministrazione dell’acido piperonilico, inibitore della biosintesi dell’acido cumarico (intermedio nella biosintesi delle antocianine e substrato della loro acilazione) determina una diminuzione del livello di specifici fenilpropanoidi e un aumento del numero di cellule con fenotipo stressato. Questi dati suggeriscono che specifici fenilpropanoidi possano avere un effetto protettivo dallo stress termico, anche se l’analisi dettagliata della correlazione fra livello di metaboliti E protezione da stress è tuttora in corso.
Ruolo biologico; Metaboliti secondari; Fenilpropanoidi; Daucus carota; Coltura cellulare; Metabolomica; Stress termico; Citocalasina D; Citoscheletro; Acido piperonilico
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