INVOLVEMENT OF RAVER1RIBONUCLEOPROTEIN IN SPLICING EVENTSDURING C2C12 MYOBLAST DIFFERENTIATION

Analisi condotte su larga scala delle sequenze espresse del genoma umano stimano che la maggior parte dei geni umani subiscono eventi di splicing alternativo con distribuzione tessuto-specifica. Oltre il 15% delle patologie genetiche umane sono associate a mutazioni nei siti di splicing e la distruzione di networks regolatori dello splicing contribuiscono allo sviluppo di numerose patologie. Lo splicing alternativo del pre-RNA messaggero (pre-mRNA) rappresenta quindi un’intensa attività regolatoria a livello post-trascrizionale che coinvolge molte proteine che legano l’RNA e molti fattori che regolano lo splicing. La proteina PTB (caratterizzata e definita come proteina che si lega a tratti di poli-pirimidine) e il suo paralogo nel tessuto nervoso, brPTB, svolgono un ruolo molto definito come regolatori negativi dello splicing nei tessuti differenziati. Raver1 e Raver2 sono proteine interagenti con PTB ma il cui ruolo, negli eventi di splicing alternativo non è ancora noto. Durante lo sviluppo muscolare PTB e brPTB regolano lo splicing alternativo di molti esoni espressi in modo tessuto specifico. In questo studio è stato indagato il contributo di Raver1 negli eventi di splicing alternativo che avvengono durante il differenziamento mioblastico di cellule C2C12. Sono stati inoltre analizzati l’espressione, la localizzazione subcellulare e il ruolo funzionale di Raver1 negli eventi di splicing alternativo di alcuni trascritti durante il processo miogenico delle cellule C2C12. Analisi di microscopia confocale mostrano che Raver1 diffonde nel citoplasma, localizzandosi in un’area citoplasmatica polarizzata durante il differenziamento dei mioblasti. La sovra-espressione di Raver1 durante la miogenesi influisce sullo splicing alternativo di esoni regolati della proteasi calpaina 3 (CAPN3) e della fosfatasi relata alla miotubularina 1 (MTMR1). Esperimenti di immunoprecipitazione dell’RNA confermano che Raver1 può legare i pre-mRNA di CAPN3 e di MTMR1 in regioni contenenti putative sequenze di riconoscimento per PTB. L’espressione di Raver2 è stata inoltre analizzata nei tessuti umani mostrando che, contrariamente a quanto avviene nel muscolo scheletrico murino, il gene Raver2 è espresso nel muscolo scheletrico umano. Questi studi mettono in luce nuovi aspetti circa il ruolo delle ribonucleoproteine nella regolazione post-trascrizionale di eventi che accadono durante lo sviluppo muscolare a livello nucleare e a livello citoplasmatico.

Large-scale expressed sequence tag and genome-wide analyses estimate that the majority of human genes undergo alternative splicing with a differential tissue distribution. More than 15% of human genetic diseases are associated to mutations in the consensus splice sites and disruption of splicing regulatory networks contributes to various diseases. Alternative splicing of pre-messenger RNA represents, consequently, an intensive post-transcriptional regulatory activity that involves several RNA binding proteins and splicing regulators. Polypyrimidine tract binding protein (PTB) and its paralog brPTB play a well established role as negative splicing regulators in differentiated tissues. Raver1 and Raver2 are proteins interacting with PTB but their role in splicing events are not understood. During muscle development PTB and brPTB regulate alternative splicing of several tissue specific exons. In the present study it has been investigated the contribution of Raver1 to splicing events occurring during myoblasts differentiation of C2C12 cells. The expression, subcellular localization and functional role of Raver1 in splicing events of selected transcripts during C2C12 myogenic process have been analyzed. The results show that Raver1 protein is expressed in proliferating undifferentiated cells as well as in differentiating myoblast cells. Confocal microscopy analyses show that Raver1 diffuses in the cytoplasm from the nucleus, localizing in polarized cytoplasmic area during myoblasts differentiation. Over-expression of Raver1 during myogenesis affects alternative splicing of regulated exons in protease calpain 3 (CAPN3) and phosphatase myotubularin-related protein 1 (MTMR1). RNA-Immunoprecipitation experiments confirm that Raver1 can bind CAPN3 and MTMR1 pre-mRNAs in regions containing putative PTB recognition sequences. Raver2 expression was also analyzed in human tissues, showing that in contrast to what happens in mouse muscle tissue, Raver2 gene is expressed in human skeletal muscle tissue. These studies may shed new light on the role of ribonucleopreoteins in the posttranscriptional regulation events that occur during muscle development in both nuclear and cytoplasmic compartments.