The oxygen-resistant hydrogenase of Thermotoga neapolitana: heterologous expression and perspectives for the production of bio-hydrogen from algae

Lo sviluppo di nuove fonti di energia rinnovabili e non inquinanti è una delle maggiori sfide per la nostra società poiché le riserve di combustibili fossili si stanno velocemente esaurendo e il continuo rilascio di CO2 nell’atmosfera è probabilmente all’origine di cambiamenti climatici globali. Diverse sono le soluzioni che si prospettano per fare fronte a questa crisi energetica ed alcune di queste sono illustrate nel capitolo 2 di questa tesi. L’idrogeno è oggi considerato tra le più promettenti alternative al petrolio come combustibile per il futuro, visto il suo elevato contenuto energetico per unità di peso e per il bassissimo impatto ambientale, dato che la sua combustione produce elettricità e acqua come unico prodotto di scarto. Nonostante i numerosi vantaggi, attualmente l’utilizzo diffuso dell‘idrogeno come fonte energetica dipende completamente dallo sviluppo di tecnologie che ne permettano una efficiente produzione su larga scala. Una delle possibili alternative per raggiungere questo scopo è l’utilizzo di sistemi biologici che siano in grado di produrre questo gas. E’ noto, infatti, che molti organismi, come i batteri e le microalghe, possiedono un metabolismo dell’idrogeno e, in condizioni di anaerobiosi, sono in grado di sviluppare H2 gassoso a partire da diversi substrati. Tra questi organismi di particolare interesse sono gli organismi fotosintetici, come l’alga verde Chlamydomonas reinhardtii, che sono in grado di produrre H2 sfruttando le risorse maggiormente disponibili in natura: la luce e l’acqua. Le conoscenze attuali sul metabolismo dell’idrogeno nelle alghe verdi e le strategie attuate al fine di sfruttare su larga scala questi organismi per produrre idrogeno sono trattati in dettaglio nella prima parte del capitolo 1. La seconda parte del capitolo 1 illustra invece le conoscenze attuali sulle idrogenasi, gli enzimi responsabili della produzione di idrogeno. Questi enzimi sono stati identificati, classificati e isolati da diversi organismi, sia batteri che alghe. In alcuni casi è stata anche risolta la struttura tridimensionale mediante cristallografia a raggi X. Questi studi hanno però evidenziato un’elevata sensibilità di questi enzimi alla presenza di ossigeno, caratteristica che ne limita l’uso su larga scala. Questo problema è particolarmente significativo nel caso degli organismi fotosintetici i quali, durante la fotosintesi, producono ossigeno; in natura infatti la produzione di H2 e O2 non avvengono mai allo stesso tempo. In un ottica applicativa, tuttavia, per rendere il processo più efficiente sarebbe necessario permettere la foto-produzione simultanea di questi due gas in Chlamydomonas. Per raggiungere questo obiettivo, tuttavia, è necessario utilizzare una idrogenasi non sensibile o meno sensibile all’ossigeno. Fino ad oggi l’unica idrogenasi con questa caratteristica è stata identificata in un batterio ipertermofilo, Thermotoga neapolitana, che è in grado di produrre idrogeno gassoso in condizioni di microaerobiosi (6- 8% di O2). A questa osservazione su cellule intere però fino ad oggi non ha fatto seguito alcuno studio volto a isolare e caratterizzare questo enzima, perciò la ragione di tale tolleranza all’ossigeno è per il momento sconosciuta. Visto l’interesse sia teorico che applicativo di questa idrogenasi, una parte di questa tesi (capitolo 3) descrive i risultati da noi ottenuti nell’analisi della porzione di genoma di T. neapolitana in cui abbiamo identificato un operone contenente le sequenze dell’idrogenasi e di altre 4 ORF (open reading frame) sconosciute, così come lo sviluppo di un sistema di espressione eterologa in E. coli volto a definire il set di proteine necessarie per ottenere l’idrogenasi correttamente assemblata e attiva enzimaticamente. Durante questo studio sono state quindi espresse, parzialmente caratterizzate e in alcuni casi purificate nove nuove proteine, che sembrano essere coinvolte in questo processo di evoluzione di H2 parzialmente resistente all’ossigeno, ma soprattutto per la prima volte è stata isolata l’idrogenasi di T. neapolitana. Lo scopo a lungo termine di questo studio svolto su proteine espresse in E. coli ed isolate in vitro è l’espressione in Chlamydomonas reinhardtii dei geni dell’idrogenasi di Thermotoga neapolitana, in modo da ottenere individui in grado di foto-produrre idrogeno anche in presenza di ossigeno. Per numerose ragioni, che sono descritte in dettaglio nel capitolo 4 di questa tesi, la strategia più promettente per inserire geni esogeni in Chlamydomonas reinhardtii è la trasformazione del genoma cloroplastico. Questo capitolo, inoltre, contiene la descrizione di un lavoro parallelo durante il quale è stato sviluppato di un nuovo vettore per la trasformazione del cloroplasto di pomodoro ed in cui sono stati condotti esperimenti di trasformazione per sovraesprimere in tali piante di una variante mutata della tossina del colera con lo scopo di sviluppare un vaccino edibile.

One of the major challenges for our society is the development of new renewable energy sources to substitute fossil fuels, which are rapidly exhausting and whose extensive exploitation caused CO2 accumulation in the atmosphere and is probably at the origin of global climatic changes. In chapter 2 of this thesis, some of the proposed solutions to face this energetic crisis are described. Among these, today, hydrogen is considered a promising option because of its high energy content and its low environment impact, since its combustion generate electricity and produce water as the only waste. The possibility of a large scale exploitation of hydrogen as energy source, however, totally depends on the development of strategies for its large scale efficient production, which are still missing. One emerging possibility is the use of biological systems: in fact, several living organisms (bacteria or green algae) are able to develop this gas in anaerobic conditions during their metabolism. The exploitation of photosynthetic organisms, as the green alga Chlamydomonas reinhardtii, is particularly interesting because here hydrogen is produced starting from two abundant natural sources: water and light. Current knowledge about hydrogen metabolism in Chlamydomonas reinhardtii and strategies attempted to face some problems for a large scale production are described in details in chapter 1. In living organisms H2 is produced by a particular class of enzymes named hydrogenases. Chapter 1 also describes principal properties of these proteins, in particular the geometry of the catalytic site and the accessory domains that have been resolved by X-ray crystallography. These studies revealed a property of these enzymes that, in an applicative point of view, is clearly limiting: a high sensitivity to even very low oxygen concentrations. This lack of enzymatic activity in aerobic conditions is especially limiting in the case of photosynthetic organisms which evolve oxygen during photosynthesis. In nature, therefore, O2 and H2 productions in Chlamydomonas never occur at the same time. In a large scale production, however, a simultaneous photo-production of both gases would have a far higher yield. Nevertheless this ideal objective is still limited by the unavailability of an O2 insensitive hydrogenase. Until now, a H2 evolution in micro-aerobic conditions (6-8%) has been demonstrated only for the hyperthermophilic bacterium Thermotoga neapolitana. Its hydrogenase however, has never been isolated and any biochemical or structural studies is available; therefore, basis of its tolerance are still completely unknown. In chapter 3 of this thesis we describe the analysis of a T. neapolitana genome portion in which we identified the hydrogenase genes as part of an operon containing 4 additional ORFs (Open Reading Frame) and the results obtained through the heterologous expression of these proteins in E. coli. In this work we thus expressed, characterized and in some cases purified nine new proteins that are probably involved in this oxygen tolerant H2 evolving process. Finally, for the first time we could purify the T. neapolitana hydrogenase correctly folded. The long term aim of this study, conduced on isolated proteins, is the insertion of T. neapolitana hydrogenase in Chlamydomonas in order to obtain an organism able to photo-produce hydrogen also in aerobic conditions. According to several advantages, described in detail in chapter 4, the most promising strategy to express heterologous genes in Chlamydomonas is the chloroplastic transformation. This chapter also contains the description of a new vector for the tomato chloroplast transformation developed in our laboratory, as well as our experiments for the production of a cholera edible vaccine in tomato.