Development of viral vector-mediated RNA interference targeting several P2X receptors in the rat central nervous system

L’RNA interference (RNAi) e’ un meccanismo di silenziamento genico sequenza-specifico, conservato durante il processo evolutivo. Il meccanismo di silenziamento e’ attivato attraverso la degradazione del mRNA complementare o mediante inibizione del processo trascrittivo o di traduzione. Nelle cellule di mammifero, l’RNAi viene indotto attraverso l’introduzione o l’espressione intracellulare di una molecola di RNA a doppio filamento di 20-22 nucleotidi (chiamata short interfering RNA o siRNA) specifica per l’mRNA bersaglio. Nel passato il processo di ricombinazione omologa in cellule embrionali era il meccanismo piu’ utilizzato per studiare la funzione di un gene di interesse in mammiferi, mediante rimozione o sovraespressione del gene stesso. Questo processo risulta pero’ costoso e non applicabile a molti organismi, inoltre la delezione del gene in esame puo’ portare a processi di compensazione genica o a fenotipi letali. Attualmente l’RNAi e’ ampiamente impiegato per determinare la funzione di un gene bersaglio sia in sistemi in vitro che in vivo grazie alla sua elevata versatilita’ ed efficienza ed e’ inoltre utilizzato nella ricerca farmaceutica per selezionare potenziali bersagli farmacologici. Questo progetto di ricerca e’ stato sviluppato allo scopo di investigare l’applicabilita’ del meccanismo di RNA interference per il silenziamento genico nel sistema nervoso centrale di ratto sia in vitro che in vivo. In particolare, il suo impiego nel processo di validazione di un gene d’interesse e’ stato analizzato in relazione al recettore purinergico P2X7, un gene potenzialmente coinvolto in patologie psichiatriche ed ai due recettori correlati P2X2 e P2X4. I recettori purinergici P2X2, P2X4 e P2X7 sono membri della famiglia di recettori-canali cationici attivati dall’ATP, permeabili al sodio, potassio e calcio. Questi recettori sono espressi in diverse aree cerebrali nei neuroni, dove sono coinvolto nel rilascio di neurotransmettitori e nell’attivazione di meccanismi multipli di trasduzione del segnale intracellulare. Il recettore P2X7 risulta inoltre espresso in diverse tipologie di cellule gliali, in cui e’ coinvolto nella modulazione dei processi neuroinfiammatori e nel rilascio di diverse citochine. Studi farmacologici e di associazione genetica suggeriscono un ruolo potenziale del recettore P2X7 nei disordini psichiatrici, inclusi la depressione unipolare e bipolare. Nel topo l’inibizione dell’mRNA per P2X7, attraverso RNA antisenso, induce un comportamento di tipo depressivo. Studi di associazione genetica indicano una correlazione tra specifici polimorfismi nel gene codificante il recettore P2X7 e i disordine bipolari (Barden et al., 2004 e 2006). I geni per i recettori P2X2 e P2X4 sono all’interno della stessa regione cromosomica di P2X7 associata con la depressione e i disordini bipolari. P2X2 e P2X4 sono inoltre espressi in specifiche aree cerebrali coinvolte nella depressione, come l’ippocampo, e potrebbero quindi svolgere un ruolo nella patofisiologia della depressione. Al fine di ottenere la soppressione dei recettori P2X (P2XR), specifiche molecole siRNAs sono state disegnate per ogni gene e sono state poi selezionate per l’attivita’ mediante trasfezione di colture primarie e linee cellulari esprimenti i geni d’interesse. In questo modo la sequenza siRNA piu’ attiva e specifica per ciascun gene e’ stata selezionata per la produzione di una cassetta esprimente un “short hairpin RNA” o shRNA che porta alla produzione del siRNA di interesse all’interno della cellula. Poiche’ lo scopo finale di questo progetto era il silenziamento a lungo termine dei recettori P2X nell’ippocampo di ratto, sono stati utilizzati i vettori virali al fine di garantire l’espressione prolungata del siRNA nei neuroni e nella glia. Infatti i vettori virali impiegati possono infettare il tessuto cerebrale con elevata efficienza e persistono episomialmente all’interno della cellula infettata. Per ottenere l’espressione dei siRNAs nei neuroni, i vettori virali Adeno-associati (AAV) esprimenti shRNA (AAV-shRNA) sono stati prodotti per ciascun gene bersaglio, poiche’ questi vettori possono infettare i neuroni con elevata efficienza. Inoltre, vettori Adenovirali 5 (Ad5)-shRNA sono stati generati per investigare l’effetto della soppressione di P2X7 nelle cellule gliali. Infatti questi vettori virali infettano preferenzialmente la glia. Per selezionare i vettori piu’ attivi e specifici in grado di sopprimere l’espressione dei recettori P2X in vivo, i vettori virali sono stati inizialmente testati in vitro in colture primarie. I vettori AAV2/6- shRNA sono stati validati mediante infezione di neuroni ippocampali. Una riduzione massima del 80-90% del mRNA dei recettori P2X e’ stata osservata mediante analisi TaqMan delle cellulare infettate. E’ stato inoltre identificato un vettore Ad5-shRNA in grado di sopprimere del 80% l’espressione del mRNA per P2X7 in astrociti primari di ratto. Dati preliminari hanno dimostrato una diminuizione nel profilo funzionale del recettore P2X7 in cellule microgliali infettate con il vettore Ad5-shRNA. Questi dati hanno indicato una riduzione statisticamente significativa del recettore bersaglio in seguito all’infezione con vettori virali esprimenti shRNA in vitro. Poiche’ le principali evidenze sperimentali, comprendenti sia studi preclinici che genetici, supportano il coinvolgimento del recettore P2X7 nella pato-fisiologia della depressione, il lavoro in vivo e’ stato focalizzato su questo gene. Pertanto sia i vettori virali AAV2/6- che Ad5-shRNA-P2X7 sono stati microinfusi in ippocampo di ratto utilizzando aghi di vetro. Questa metodica di microiniezione e’ stata selezionata in quanto in grado di indurre un livello minimo di danno anatomico nel sito di iniezione. In seguito all’infusione dei vettori virali, la soppressione del gene bersaglio e’ stata investigata. Nel lavoro in vivo e’ stata dimostrata con successo l’infezione rispettivamente di neuroni e cellule gliali in seguito all’iniezione nella regione ippocampale del giro dentato (DG) con i vettori virali AAV2/6- e Ad5-shRNA. Inoltre una riduzione statisticamente significativa del mRNA per P2X7 e’ stata rilevata mediante ibridazione in situ nei campioni iniettati con AAV-P2X7-shRNA rispetto al controllo. Una tendenza simile e’ stata riscontrata nei campioni iniettati con vettore Ad5-P2X7-shRNA. In conclusione, in questo studio sono stati generati e validati vettori virali esprimenti shRNA attivi e specifici, in grado di sopprimere l’espressione del gene bersaglio in cellule neuronali sia in vitro che in vivo.

RNA interference (RNAi) is an evolutionarily conserved process of sequencespecific post-transcriptional gene silencing that is triggered by double-stranded short interfering RNA (siRNA). At present RNAi has become an important and widely used tool for evaluating target gene function both in vitro and in vivo and has been used for the screening of potential therapeutic targets in pharmaceutical research. This project has been carried out in order to investigate the applicability of RNA interference for target gene suppression in the rat central nervous system (CNS) both in vitro and in vivo. In particular its application in the process of target validation has been evaluated focusing on the purinergic receptor P2X7, a putative target for mood disorders and the two related receptors P2X2 and P2X4. The purinergic receptor P2X7 together with the P2X2 and P2X4 receptors are members of the ATP-gated cation channel family permeable to sodium, potassium and calcium. These receptors are expressed in neurons in many regions of the brain where they play a role in release of neurotransmitters and activation of multiple intracellular signaling pathways. The P2X7 gene is also expressed in several types of glia where it is involved in the modulation of neuroinflammatory processes and cytokine release. In order to obtain P2X receptor (P2XR) suppression, specific siRNAs were designed for each gene and screened for activity by transfecting both primary cells and cell lines expressing the target genes. In this way the most active and specific siRNA sequence for each gene was selected for the production of a short hairpin RNA (shRNA) cassette leading to intracellular production of the targeting siRNA sequence. Viral vectors have been used for long term siRNA expression in neurons and glia in the brain since these vectors can efficiently transduce brain tissue and persist episomally within the infected cell. In order to drive siRNA expression in neuronal cells, Adeno-associated viral vectors (AAV) containing an shRNA cassette were produced for each target gene, since these vectors can infect neurons with high efficiency. Adenovirus 5 (Ad5)-shRNA vectors targeting P2X7 were also produced to investigate the effects of P2X7 suppression in glia since these viral vectors preferentially infect glia. As a filter to select the most active and specific viral vectors that could down-regulate P2XRs in vivo, viral vectors were first tested in vitro in primary cells. The AAV2/6-shRNA vectors were evaluated by infecting hippocampal neurons. A maximum of 80-90% down-regulation of P2XR mRNA was observed by TaqMan analysis of the infected cells. An active Ad5-shRNA vector able to suppress of 80% P2X7 mRNA expression in cultured rat astrocytes was also identified. Preliminary data demonstrated a statistically significant decrease in P2X7 function in Ad5-shRNA infected microglial cells. These data indicate the suppression of target receptor after shRNA viral vector delivery in vitro. Both the AAV2/6- and Ad5-shRNA-P2X7 viral vectors were then microinfused into rat hippocampus though glass needles. Transduction of neurons and glia respectively after infection of the dentate gyrus (DG) region of the hippocampus by AAV2/6- and Ad5-shRNA vectors was demonstrated. Moreover a statistically significant down-regulation of P2X7 mRNA in AAV-P2X7-shRNA injected DG compared to controls was revealed by in situ hybridization. A similar trend was observed in the Ad5-P2X7-shRNA injected samples. In conclusion, in this study active and specific shRNA-viral vectors able to suppress target gene expression in neuronal cells both in vitro and in vivo were generated and validated.