Sviluppo di metodiche di tracciabilità molecolare per l'identificazione di specie, in matrici semplici e complesse, di origine animale e vegetale

Diversi fenomeni, legati alla globalizzazione, quali la comparsa nei mercati di nuovi prodotti alimentari e iniziative di promozione per i prodotti locali con la creazione di marchi di origine, hanno creato la necessità di sviluppare nuove metodiche analitiche atte a garantire la qualità e il rispetto degli innumerevoli requisiti di legge imposti sulle produzioni alimentari. Nel presente lavoro di tesi vengono trattati diversi aspetti della tracciabilità di filiera alimentare valutando la possibilità di applicare metodiche innovative alla risoluzione di problematiche reali. Nel primo capitolo viene trattata la problematica relativa al rilevamento di matrici allergeniche all’interno di alimenti. Vengono confrontate a tale scopo due metodiche molecolari quali la PCR e la Real-time PCR con l’utilizzo di particolari sonde UPL sviluppate commercialmente da Roche. I risultati mostrano chiaramente il vantaggio, in termini di sensibilità di rilevazione, ottenibile mediante l’impiego della metodica di Real-time PCR con sonde UPL che permette di ottenere limiti di rilevabilità fino a tre ordini di grandezza inferiori rispetto alla tradizionale metodica di PCR. La semplicità della metodica sviluppata, i costi relativamente contenuti e l’elevata sensibilità, in linea con le esigenze normative, contribuiscono a fare di questo approccio un valido strumento per il rilevamento di matrici allergeniche in campo alimentare. Nella seconda parte del lavoro vengono indagate le enormi potenzialità della tecnica del DNA barcoding per quanto riguarda l’identificazione di specie animali. In particolare è stata sviluppata una piattaforma APEX microarray che, utilizzando i dati ottenuti mediante DNA barcoding, risulta in grado di essere un potente, economico e rapido strumento di identificazione. Le prestazioni di questa innovativa piattaforma sono state applicate con successo all’identificazione di cinque specie ittiche di rilevante interesse economicocomerciale. L’ultima parte del lavoro riguarda la ricerca e la valutazione in termini di amplificabilità e informatività di possibili geni candidati come barcode universali per il regno vegetale. La valutazione dei geni è stata svolta su una collezione di specie vegetali appartenenti al genere Passiflora che riveste notevoli interessi sia in campo alimentare che in campo medicoscientifico. Sono stati individuati due geni, rpoC1 ed ncpGS, in grado di fornire una buona discriminazione di specie all’interno del genere Passiflora. Adottando un approccio multilocus, è stato inoltre possibile incrementare l’accuratezza dell’identificazione e la definizione degli alberi filogenetici generati.

Several phenomena related to globalization, such as the emergence of new food products and initiatives to promote local products with the creation of labels of origin, have led to the need to develop new analytical methods to ensure quality and compliance with the legal requirements imposed on food production. The present study dealt with different aspects of food chain traceability by assessing the ability to apply innovative methods to solve real problems. The first chapter deals with the problematic of allergenic matrix detection in food products. For this purpose two molecular methods have been compared, namely PCR and Real-time PCR using specific UPL probes commercially developed by Roche. The results clearly show the advantage in terms of detection sensitivity using the method of Real-time PCR with UPL probes that allowed us to obtain detection limits up to three orders of magnitude lower than the traditional method of PCR. The simplicity of the methodology developed, the relatively low cost and the high sensitivity, in line with regulatory requirements, make this approach a reliable tool for allergen detection in food matrix. In the second part of this work we have investigated the enormous potential of DNA barcoding technique for the identification of animal species. We have developed an APEXmicroarray plateform that is a powerful, economical and rapid instrument for species identification, using data obtained by DNA barcoding. The performances of this innovative plateform have been successfully applied for the identification of five fish species of commercial interest. The last part of this thesis concerned the research and the evaluation in terms of amplificability and informativity of potential candidate genes as universal barcodes for the vegetal kingdom. Gene assessment has been carried out on a collection of plant species belonging to Passiflora genus that possesses noteworthy interests in food field as well as in medical field. Two genes, namely rpoC1 and ncpGS, have been found to be able to discriminate species in Passiflora genus. Using a multilocus approach we have been able to improve the accuracy of the identification and the definition of phylogenetic trees.