Benchmarking of differential abundance methods and development of bioinformatics and statistical tools for metagenomics data analysis

Microbiome and metagenomics data analysis has been the main theme of my PhD programme. As a main goal, the thesis moves from the observed limitations of the differential abundance analysis tools to a benchmark and a framework against which they could be measured and compared. Furthermore, as a secondary goal, the presentation of some case studies wants to emphasise the need for a sound exploratory and inferential statistical analysis in metabarcoding data. Firstly, I present two closely related studies in which differential abundance analysis methods play the main role. The differential abundance analysis is the principal approach to detect differences in microbial community compositions between different sample groups, and hence, for understanding microbial community structures and the relationships between microbial compositions and the environment. I start by introducing a benchmarking study in which differential abundance analysis methods, even from different domains (e.g., RNA-Seq and single-cell RNA-Seq), were used in a collection of microbiome datasets to evaluate their performance. Then, I continue with the presentation of software package that I developed from the results obtained in the previous research. The software package, in R language, is currently available on Bioconductor (i.e., an open-source software platform for analysing and visualising biological data). It allows users to replicate the benchmarking of differential abundance analysis methods and evalute their performances on their own datasets. Secondly, I highlight the microbiome data analysis challenges presenting two case studies about the human microbiome and its composition and dynamics in both disease and healthy states. In the first study, healthy volunteers were treated with a probiotic mixture and the changes in the gut microbiome were studied in conjunction with some psychological aspects. A careful data exploration, clustering, and mixed-effects regression models, unveiled subject-specific effects and the presence of different bacteriotypes which masked the probiotic effect. Instead, in the second study I show how to identify disease-related microbial biomarkers for eosinophilic oesophagitis (i.e., a chronic immune-mediated inflammatory disease of the oesophagus that causes dysphagia, food impaction of the oesophagus, and esophageal strictures) from saliva. Despite the low sample size it was possible to train a model to discriminate between case and control states with a decent accuracy. While still premature, this represents a promising step for the non-invasive diagnosis of eosinophilic oesophagitis which is now possible only through esophageal biopsy.

L'analisi di dati nell'ambito del microbioma e della metagenomica è stato il tema principale del mio dottorato. L'obiettivo primario di questa tesi si muove attorno all'osservazione dei limiti dei metodi per lo studio dell'abbondanza differenziale e culmina con la creazione di un framework analitico che permette la loro misurazione e comparazione. Come obiettivo secondario, inoltre, la tesi vuole enfatizzare la necessità di una solida analisi statistica esplorativa ed inferenziale nei dati di metabarcoding, tramite la presentazione di alcuni casi studio. Inizio presentando 2 studi strettamente collegati in cui i metodi per l'analisi di abbondanza differenziale sono i protagonisti. L'analisi di abbondanza differenziale è lo strumento principale per individuare differenze nelle composizioni delle comunità microbiche in gruppi di campioni di diversa provenienza. Rappresenta quindi il primo passo per la comprensione delle comunità microbiche, delle relazioni tra i loro membri e di questi con l'ambiente. Il primo studio riguarda un lavoro di confronto tra metodi. A partire da una collezione di dataset metagenomici, l'obiettivo era di valutare le performance di metodi per l'analisi dell'abbondanza differenziale, anche nati in altri ambiti di ricerca (e.g., RNA-Seq e single-cell RNA-Seq). Invece, con il secondo studio presento un software che ho sviluppato grazie ai risultati ottenuti dalla precedente ricerca. Attualmente, il pacchetto software, in linguaggio R, è disponibile su Bioconductor (i.e., una piattaforma open-source per l'analisi e la visualizzazione di dati biologici). Esso consente agli utenti di replicare sui propri dataset il confronto tra metodi per lo studio dell'abbondanza differenziale e la conseguente analisi delle performance. Infine, mostro alcune delle sfide che ho incontrato nell'analisi di questo tipo di dato attraverso 2 casi studio riguardanti il microbioma umano, la sua composizione e dinamica, sia in stato di salute che malattia. Nel primo studio, dei soggetti sani sono stati trattati con una mistura di probiotici per valutare variazioni del microbiota intestinale ed eventuali associazioni con alcuni aspetti psicologici. Un'attenta analisi esplorativa, l'impiego di tecniche di clustering e l'utilizzo di modelli di regressione lineare ad effetti misti hanno consentito di svelare un forte effetto soggetto-specifico e la presenza di diversi batteriotipi di partenza che mascheravano l'effetto complessivo del trattamento probiotico. Invece, nel secondo studio mostro come, a partire da campioni salivari, sono stati individuati dei biomarcatori associati all'esofagite eosinofila (i.e., una malattia cronica immuno-mediata a carico dell'esofago che causa disfagia, occlusioni e stenosi esofagee). Nonostante la bassa numerosità campionaria è stato possibile costruire un modello per discriminare tra casi e controlli con una buona accuratezza. Anche se ancora prematuro, questo risultato rappresenta un passo promettente verso la diagnosi non invasiva di questa malattia che per il momento viene fatta solo tramite biopsia esofagea.