A simple method to measure CFTR-dependent iodide transport in peripheral blood leukocytes: mutant HS-YFP assay

Cystic Fibrosis is a multi organ hereditary disease caused by a mutation in the gene coding for Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator protein (CFTR).The different mutations of the CFTR gene were divided into 6 classes on the basis of molecular defects and the consequent functional alterations. Depending on the type of mutation, the protein may be more or less expressed and functioning. This involves varying degrees of disease severity and not only between different mutations but also between patients having the same mutation. Research carried out to date to try to cure the basic defect has led to good but not sufficient results. In order to test promising drugs able to rescue the expression and function of CFTR are necessary easy and fast methods and the use of primary cells from the individual patients. Leukocytes are recognized in the scientific literature as key component of the pathogenetic events associated to cystic fibrosis. Leukocytes, especially monocytes, represent an easily accessible source of primary cells that might be exploited to monitor CFTR expression and activity. Based on previous work I was involved in the development of a new assay to measure CFTR activity suitable to be used in primary cells. The readout of this method is based on residue quantity of iodide present in the supernatant, after proper stimulation, quantified by the quenching of the fluorescence of Halide Sensitivity Yellow Fluorescence Protein (GST-HS-YFP). The specificity of the assay for CFTR activity was tested using two different CFTR inhibitors, CFTR-172 and PPQ-102, in MM6 cells and after silencing of MM6 with CFTR siRNA. These data were confirmed also in primary Leukocytes, where we recorded a significant difference between WT and CF PBMCs and Monocytes (p<0,005). GST-HS-YFP assay can represent easy and fast methods to measure the CFTR function in Leukocytes from CF patients during clinical trials and another useful technique applicable in different cell types to perform new drugs screening

La fibrosi cistica è una malattia ereditaria multiorgano causata da una mutazione nel gene codificante per la proteina di regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Le diverse mutazioni del gene CFTR sono state divise in 6 classi sulla base di difetti molecolari e delle conseguenti alterazioni funzionali. A seconda del tipo di mutazione, la proteina può essere più o meno espressa e funzionante. Questo comporta diversi gradi di gravità della malattia e non solo tra diverse mutazioni ma anche tra pazienti che hanno la stessa mutazione. La ricerca effettuata fino ad oggi per cercare di curare il difetto di base ha portato a risultati buoni ma non sufficienti. Al fine di testare farmaci promettenti in grado di aumentare l'espressione e la funzione di CFTR sono necessari metodi facili e veloci e l'uso di cellule primarie derivanti dai singoli pazienti. I leucociti sono riconosciuti nella letteratura scientifica come componente chiave degli eventi patogenetici associati alla fibrosi cistica. I leucociti, in particolare i monociti, rappresentano una fonte facilmente accessibile di cellule primarie che potrebbero essere sfruttate per monitorare l'espressione e l'attività di CFTR. Sulla base di lavori precedenti sono stata coinvolta nello sviluppo di un nuovo test per misurare l'attività di CFTR. Il risultato di questo metodo si basa sulla quantità residua di ioduro presente nel surnatante, dopo opportuna stimolazione, quantificata dalla estinzione della fluorescenza della proteina a fluorescenza gialla ad alta sensibilità (GST-HS-YFP). La specificità del dosaggio per l'attività CFTR è stata testata utilizzando due diversi inibitori CFTR, CFTR-172 e PPQ-102, in cellule MM6 e dopo il silenziamento di MM6 con siRNA CFTR. Questi dati sono stati confermati anche nei leucociti primari, dove è stata registrata una differenza significativa tra WT e CF PBMC e Monociti (p <0,005). Il dosaggio GST-HS-YFP può rappresentare un metodo semplice e veloce per misurare la funzione CFTR nei leucociti da pazienti CF durante gli studi clinici e un'altra tecnica applicabile in diversi tipi di cellule per eseguire lo screening di nuovi farmaci.