Handling light safely: the function of higher plants antenna systems analyzed by reverse genetic

The aim of this thesis is to understand the molecular basis of the mechanisms regulating light harvesting and photoprotection in higher plants. NPQ, the major photoprotective mechanisms of PSII, responds to variations in light intensity, working as a safety valve to reduce the excitation pressure in the photosystem. To identify the site(s) of quenching within the PSII antenna system, the partners in quenching reactions and the biophysical mechanism by which the quenching reactions are initiated, we constructed and characterize NoM mutant, lacking all monomeric LHC proteins while retaining LHCII trimers. Further, we introduced the npq1, and lut2 mutations, and found that lack of monomeric antennae changed the xanthophyll-dependence of the residual NPQ activity. We concluded that NPQ is catalyzed by 2 independent mechanisms with the fastest activated response catalyzed within monomeric LHC proteins depending on the formation of radical cation, while LHCII was responsible for the slowly component, which does not depend on lutein, while zeaxanthin was essential. Then we investigated the role of LHCI in the photoprotection of PSI, by focusing on carotenoid-protein interaction. We analyzed the mutants szl1, with a lower carotene content, and npq1, with suppressed zeaxanthin formation. Despite zeaxanthin bound LHCI under excess light, it neither enhanced photoprotection of the supercomplex. Instead, szl1 plants displayed a far stronger photoinhibition of PSI than WT plants and a greater level of 3Chl* originating in the LHCI moiety. We conclude that a crucial mechanism is mediated by carotenes bound to LHCI, which is instrumental in reducing the yield of harmful 3Chl*. To elucidate the specific function of LHCI, the phenotype of an Arabidopsis mutant devoid of the LHCI system (ΔLhca) was studied over a range of conditions. Lack of LHCI could not be compensated by over-accumulation of other LHC gene products, thus showing that PSI-LHCI is a stable system, lacking the dynamic properties of PSII. Capacity of building a trans-thylakoid ΔpH gradient, redox balance of photosynthetic membrane and growth rate were all impaired in the mutant, especially under conditions of rapidly changing light. Mutant compensates for decreased antenna size by strongly enhancing LHCII binding to PSI with respect to the WT, as a strategy aimed at alleviating the imbalance in the excitation energy between PSs. Indeed, by comparing the excitation energy transfer efficiency properties of WT and mutant PSI-LHCII complexes, we found that LHCII is a very good antenna when bound to PSI core complex, independently on the presence of LHCI. However, under conditions of fluctuating light, the redox unbalance displayed by ΔLhca plants reveals that the depletion of LHCI cannot be entirely compensated, despite greatly enhancing the transition to state II. LHCII absorbs the same wavelengths when bound to PSI or PSII; therefore, besides lower pigment content, absence of far-red spectral forms further disadvantage light-harvesting capacity of PSI-LHCII, due to the “shading” effect by the abundant PSII-LHCII antenna system. The hypothesis was confirmed by comparing growth of WT and mutant plants under lamps either enriched or devoid of far-red wavelengths. All these results point to a crucial role of the LHCI in optimizing linear electron flow, particularly in limiting light conditions, and in the adaptation of plants to life under ever-changing light conditions, typical of canopies.

L’obiettivo di questa tesi è comprendere le basi molecolare dei meccanismi che regolano la raccolta della luce e della fotoprotezione nelle piante superiori. Uno dei principali meccanismi di fotoprotezione del PSII è il non photochemical quenching (NPQ), esso risponde alle variazioni dell'intensità luminosa lavorando come valvola di sicurezza per ridurre la sovra-eccitazione nel fotosistema: dissipando sotto forma di calore l’energia assorbita in eccesso. Allo scopo di identificare tale meccanismo biofisico, i partner coinvolti e il sito nel quale avviene, è stato isolato e caratterizzato un mutante di Arabidopsis thaliana privo delle antenne monomeriche del PSII, denominato NoM. Quest’ultimo inoltre è stato incrociato con delle linee mutanti, le quali impediscono, rispettivamente, la sintesi di zeaxantina e luteina o l'accumulo di PSBS. I risultati ottenuti suggeriscono che NPQ è catalizzato da 2 meccanismi indipendenti: la risposta più rapida viene attivata e catalizzata all'interno delle antenne monomeriche e dipende dalla formazione del radicale cationico, mentre le antenne maggiori (trimeri LHCII) sono responsabili della componente più lenta, nella quale la zeaxantina risulta essere cruciale. Successivamente è stata esaminata la fotoprotezione del PSI, a tale scopo sono stati utilizzati una serie di mutanti di Arabidopsis alterati nella biosintesi dei carotenoidi e delle xantofille. In particolare è stato analizzato il mutante szl1, che presenta un’alterata composizione delle xantofille e un contenuto di β-carotene inferiore rispetto al wild type, il mutante npq1 incapace di sintetizzare zeaxantina e il mutante szl1-npq1 che combina le caratteristiche di entrambi. In condizioni di eccesso di luce, analisi su piante/complessi isolati PSI-LHCI hanno rivelato che la zeaxantina non ha effetto nel proteggere il PSI, mentre il β-carotene svolge un ruolo fondamentale riducendo la formazione di clorofilla tripletto (3Chl*), la quale può interagire con l’ossigeno e formare ROS. Infine per chiarire la funzione specifica delle antenne del PSI (LHCI), è stato isolato un mutante di Arabidopsis privo del sistema LHCI (ΔLhca), esso è caratterizzato da un alterato stato redox del plastochinone, indice di uno sbilanciamento nell’assorbimento di energia tra PSI e PSII e da un ridotto tasso di crescita in tutte le condizioni testate, soprattutto sottoponendo le piante ad un regime di luce pulsata. La mancanza di LHCI non viene compensata da un sovraccumulo di altri prodotti genici della famiglia LHC, dimostrando quindi che PSI-LHCI è un sistema stabile, privo delle proprietà dinamiche di PSII. Il mutante compensa la ridotta dimensione dell'antenna incrementando fortemente la migrazione dei trimeri LHCII dal PSII al PSI, come strategia volta ad alleviare lo squilibrio nell'assorbimento dell’energia di eccitazione tra i due fotosistemi. LHCII assorbe alle stesse lunghezze d'onda quando legato al PSI o al PSII; quindi l'assenza di forme spettrali in grado di assorbire fotoni nel rosso lontano, caratteristico delle antenne LHCI, riduce ulteriormente la capacità di raccolta della luce nel mutante in quanto vi è una competizione tra PSII e PSI per gli stessi fotoni. Tutti questi risultati indicano un ruolo fondamentale dell'LHCI nell'ottimizzazione del flusso elettronico lineare, in particolare in condizioni di luce limitante, e nell'adattamento delle piante a condizioni di luce sempre mutevoli, tipiche dell’ambiente naturale.