Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by memory loss and cognitive dysfunctions that drive towards a final stage of total incapability of managing self-care. The main pathological features are brain atrophy, neuronal and synaptic loss, β-amyloid accumulation, plaques deposition and neurofibrillary tangles formation. Nowadays there is no treatment able to cure this disease, but several drugs are administered to patients to ease the symptoms and slow the disease progression. This PhD thesis has had the aim to study distinct aspects of AD pathology within the hippocampus and entorhinal cortex, key areas attaint by the AD pathology and responsible of the memory loss and behavioural impairments, in the 3xTg-AD mouse model by using a detailed and distinct immunohistochemical approach. In chapter 3, I reported the analysis of the immunoreactivity changes of the Calcium sensing receptor (CaSR) in the hippocampus of the 3xTg-AD mice. CaSR has been previously demonstrated to be involved in AD through its direct interaction with exogenous Aβ peptides which activate CaSR and subsequently induce the hyperproduction and secretion of Aβ itself. CaSR immunoreactivity measurement in the hippocampus of the 3xTg-AD mice showed an increase of its expression in specific areas involved also by early Aβ accumulation and plaques depositions such as the Cornu Ammonis 1 (CA1) and the dentate gyrus. In chapter 4, the alteration of calcium binding proteins such as parvalbumin and calretinin, which are specifically expressed in GABAergic interneurons subpopulation, has been studied in the hippocampus of 3xTg-AD mice 18 months old, when the presence of -amyloid and tangles is evident. In this study, a decrease in the numerical density (Nv) of parvalbumin and calretinin neurons was identified in the CA1 region of hippocampus. This work characterizes and indicates a specific neuronal and regional vulnerability underestimated in AD, which could be key to better elucidate the neuronal circuits that are affected during the pathology progression. Finally, in chapter 5 is reported the study of the alterations of the trophic factor S100 which is an important astrocytic marker and whose characterization in the 3xTg-AD mice might help to highlight the potential astrocytic dysfunction hypothesis. A Nv and morphological analysis were performed in the S100β-positive cells within the entorhinal cortex of mice from 1 month until 18 months of age. Whilst the Nv was not altered, an increase in the S100β-positive profiles was identified at 18 months of age both in aged and 3xTg-AD mice compared to younger mice and a significant increase was found also between the 3xTg-AD and non-transgenic animals at 18 months of age. Altogether these three studies demonstrate how complicated and variable is the aetiology and progress of AD and highlight the need to deeply investigate more targets other than neuronal pathology to further understand the pathologic mechanisms of this disease and its progression. Furthermore, a deep characterization of animal models such as the 3xTg-AD mice is necessary to have a strong background knowledge of the pathological features and alterations present in them in order to achieve a better understanding and interpretation of the potential and possible outcomes which could direct us for the always important and key aspects of drug testing.

Il morbo di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da perdita di memoria e disfunzioni cognitive che includono problemi nel linguaggio, disorientamento, perdita delle capacità di organizzazione e pianificazione ed altri sintomi neuropsichiatrici fino al raggiungimento di uno stadio finale in cui il paziente necessita una assistenza totale. Le principali caratteristiche patologiche sono l’atrofia corticale, la perdita di neuroni e sinapsi, l’accumulo di proteina β-amiloide, la deposizione di placche neuritiche e la formazione di grovigli neurofibrillari composti dalla proteina tau iperfosforilata. Il lavoro di ricerca condotto durante il mio dottorato ha avuto lo scopo di studiare, mediante l’impiego di un approccio immunoistologico, diversi tipi di alterazioni nell’ippocampo e nella corteccia entorinale del topo triplo transgenico per l’Alzheimer (3xTg-AD). Nel Capitolo 3 di questa tesi viene descritta una alterazione nell’espressione del “Calcium sensing receptor” (CaSR) nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD. Precedenti studi hanno dimostrato la capacità dei peptidi di β-amiloide di interagire ed attivare il CaSR, il quale in seguito a questa interazione induce l’iperproduzione e secrezione della stessa β-amiloide. Successivamente all’innesco di questo meccanismo patogenetico, il CaSR risulta anche iperespresso. L’analisi dell’espressione del CaSR nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD ha dimostrato un suo aumento in specifiche aree coinvolte nell’accumulo iniziale di β-amiloide e nella successiva deposizione di placche, quali il Cornu Ammonis 1 (CA1) e il giro dentato (DG). Nel capitolo 4, le “calcium binding proteins” quali parvalbumina e calretinina sono state studiate nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD a 18 mesi di età seguendo l’ipotesi riguardante la disomeostasi del calcio nella patogenesi e progressione del morbo di Alzheimer. Queste proteine sono oltretutto un marker molto utilizzato per differenti sottopopolazioni di interneuroni inibitori GABAergici. In questo studio è stata identificata una diminuzione nella densità numerica (Nv) dei neuroni positivi per parvalbumina e calretinina nella regione CA1 dell’ippocampo, la quale corrisponde all’area con maggior carico di placche di β-amiloide in questo modello animale. Infine, nel capitolo 5 è riportato lo studio delle alterazioni degli astrociti positivi per S100β nei topi 3xTg-AD al fine di studiare un’ulteriore ipotesi per la malattia di Alzheimer che consiste nella “disfunzione astrocitaria”. A questo scopo, sono state analizzate la Nv e le caratteristiche morfologiche (superficie e volume dell’intera cellula, dei processi e del soma) delle cellule positive per S100β nella corteccia entorinale di topi da 1 a 18 mesi di età. Mentre la Nv è risultata inalterata, è stato rilevato un generale aumento dei profili positivi per S100β ai 18 mesi di età sia nei topi 3xTg-AD, sia in quelli non transgenici. Un aumento ancor più significativo è stato però misurato nei topi 3xTg-AD quando paragonati ai non transgenici. In conclusione, questi tre studi mettono in luce la necessità di studiare più a fondo anche ulteriori meccanismi patogenetici che esulano dalla semplice patologia neuronale. Inoltre, la caratterizzazione dettagliata di modelli animali come i topi 3xTg-AD utilizzati in questo lavoro è necessaria per poter avere una profonda conoscenza di base delle caratteristiche patologiche presenti in essi, in modo tale da avere una miglior pianificazione e comprensione degli esiti che possono derivare dal loro utilizzo nel test di nuovi farmaci. La riproduzione in futuro di questi studi su materiale umano potrebbe fornire un punto di partenza per un approccio terapeutico combinato che riguardi un corretto ripristino funzionale sia dei neuroni che della glia nonché una strategia differente e più mirata per il blocco della produzione anomala della proteina β-amiloide.

Calcium Sensing Receptor, Calcium Binding Proteins and Astrocytic Changes in Alzheimer’s Disease

Gardenal, Emanuela
2017-01-01

Abstract

Il morbo di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da perdita di memoria e disfunzioni cognitive che includono problemi nel linguaggio, disorientamento, perdita delle capacità di organizzazione e pianificazione ed altri sintomi neuropsichiatrici fino al raggiungimento di uno stadio finale in cui il paziente necessita una assistenza totale. Le principali caratteristiche patologiche sono l’atrofia corticale, la perdita di neuroni e sinapsi, l’accumulo di proteina β-amiloide, la deposizione di placche neuritiche e la formazione di grovigli neurofibrillari composti dalla proteina tau iperfosforilata. Il lavoro di ricerca condotto durante il mio dottorato ha avuto lo scopo di studiare, mediante l’impiego di un approccio immunoistologico, diversi tipi di alterazioni nell’ippocampo e nella corteccia entorinale del topo triplo transgenico per l’Alzheimer (3xTg-AD). Nel Capitolo 3 di questa tesi viene descritta una alterazione nell’espressione del “Calcium sensing receptor” (CaSR) nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD. Precedenti studi hanno dimostrato la capacità dei peptidi di β-amiloide di interagire ed attivare il CaSR, il quale in seguito a questa interazione induce l’iperproduzione e secrezione della stessa β-amiloide. Successivamente all’innesco di questo meccanismo patogenetico, il CaSR risulta anche iperespresso. L’analisi dell’espressione del CaSR nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD ha dimostrato un suo aumento in specifiche aree coinvolte nell’accumulo iniziale di β-amiloide e nella successiva deposizione di placche, quali il Cornu Ammonis 1 (CA1) e il giro dentato (DG). Nel capitolo 4, le “calcium binding proteins” quali parvalbumina e calretinina sono state studiate nell’ippocampo dei topi 3xTg-AD a 18 mesi di età seguendo l’ipotesi riguardante la disomeostasi del calcio nella patogenesi e progressione del morbo di Alzheimer. Queste proteine sono oltretutto un marker molto utilizzato per differenti sottopopolazioni di interneuroni inibitori GABAergici. In questo studio è stata identificata una diminuzione nella densità numerica (Nv) dei neuroni positivi per parvalbumina e calretinina nella regione CA1 dell’ippocampo, la quale corrisponde all’area con maggior carico di placche di β-amiloide in questo modello animale. Infine, nel capitolo 5 è riportato lo studio delle alterazioni degli astrociti positivi per S100β nei topi 3xTg-AD al fine di studiare un’ulteriore ipotesi per la malattia di Alzheimer che consiste nella “disfunzione astrocitaria”. A questo scopo, sono state analizzate la Nv e le caratteristiche morfologiche (superficie e volume dell’intera cellula, dei processi e del soma) delle cellule positive per S100β nella corteccia entorinale di topi da 1 a 18 mesi di età. Mentre la Nv è risultata inalterata, è stato rilevato un generale aumento dei profili positivi per S100β ai 18 mesi di età sia nei topi 3xTg-AD, sia in quelli non transgenici. Un aumento ancor più significativo è stato però misurato nei topi 3xTg-AD quando paragonati ai non transgenici. In conclusione, questi tre studi mettono in luce la necessità di studiare più a fondo anche ulteriori meccanismi patogenetici che esulano dalla semplice patologia neuronale. Inoltre, la caratterizzazione dettagliata di modelli animali come i topi 3xTg-AD utilizzati in questo lavoro è necessaria per poter avere una profonda conoscenza di base delle caratteristiche patologiche presenti in essi, in modo tale da avere una miglior pianificazione e comprensione degli esiti che possono derivare dal loro utilizzo nel test di nuovi farmaci. La riproduzione in futuro di questi studi su materiale umano potrebbe fornire un punto di partenza per un approccio terapeutico combinato che riguardi un corretto ripristino funzionale sia dei neuroni che della glia nonché una strategia differente e più mirata per il blocco della produzione anomala della proteina β-amiloide.
Alzheimer
CaSR
Calcium Binding Proteins
Astrocytes
Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by memory loss and cognitive dysfunctions that drive towards a final stage of total incapability of managing self-care. The main pathological features are brain atrophy, neuronal and synaptic loss, β-amyloid accumulation, plaques deposition and neurofibrillary tangles formation. Nowadays there is no treatment able to cure this disease, but several drugs are administered to patients to ease the symptoms and slow the disease progression. This PhD thesis has had the aim to study distinct aspects of AD pathology within the hippocampus and entorhinal cortex, key areas attaint by the AD pathology and responsible of the memory loss and behavioural impairments, in the 3xTg-AD mouse model by using a detailed and distinct immunohistochemical approach. In chapter 3, I reported the analysis of the immunoreactivity changes of the Calcium sensing receptor (CaSR) in the hippocampus of the 3xTg-AD mice. CaSR has been previously demonstrated to be involved in AD through its direct interaction with exogenous Aβ peptides which activate CaSR and subsequently induce the hyperproduction and secretion of Aβ itself. CaSR immunoreactivity measurement in the hippocampus of the 3xTg-AD mice showed an increase of its expression in specific areas involved also by early Aβ accumulation and plaques depositions such as the Cornu Ammonis 1 (CA1) and the dentate gyrus. In chapter 4, the alteration of calcium binding proteins such as parvalbumin and calretinin, which are specifically expressed in GABAergic interneurons subpopulation, has been studied in the hippocampus of 3xTg-AD mice 18 months old, when the presence of -amyloid and tangles is evident. In this study, a decrease in the numerical density (Nv) of parvalbumin and calretinin neurons was identified in the CA1 region of hippocampus. This work characterizes and indicates a specific neuronal and regional vulnerability underestimated in AD, which could be key to better elucidate the neuronal circuits that are affected during the pathology progression. Finally, in chapter 5 is reported the study of the alterations of the trophic factor S100 which is an important astrocytic marker and whose characterization in the 3xTg-AD mice might help to highlight the potential astrocytic dysfunction hypothesis. A Nv and morphological analysis were performed in the S100β-positive cells within the entorhinal cortex of mice from 1 month until 18 months of age. Whilst the Nv was not altered, an increase in the S100β-positive profiles was identified at 18 months of age both in aged and 3xTg-AD mice compared to younger mice and a significant increase was found also between the 3xTg-AD and non-transgenic animals at 18 months of age. Altogether these three studies demonstrate how complicated and variable is the aetiology and progress of AD and highlight the need to deeply investigate more targets other than neuronal pathology to further understand the pathologic mechanisms of this disease and its progression. Furthermore, a deep characterization of animal models such as the 3xTg-AD mice is necessary to have a strong background knowledge of the pathological features and alterations present in them in order to achieve a better understanding and interpretation of the potential and possible outcomes which could direct us for the always important and key aspects of drug testing.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la pérdida de memoria y disfunciónes cognitivas, entre las cuales se incluyen problemas del lenguaje, desorientación, pérdida de la capacidad de organicación y planificación y otros síntomas neuropsiquiátricos, hasta la llegada a un estadio final, en el cual el paciente precisa de una asistencia total. Las principales características patológicas son la atrofia cortical, la pérdida de neuronas y sinápsis, la acumulación de la proteína β-amiloide, la deposición de placas seniles y la formación de ovillos neurofibrilares (MNFs) constituidos por la proteína tau hiperfosforilada. El trabajo de investigación desarrollado a lo largo de mi periodo de doctorando ha centrado su objetivo en estudiar, por medio del empleo de técnicas immunohistológicas, los diferentes tipos de alteraciones que tienen lugar en el hipocampo, así como en la corteza entorrinal de ratones 3xTg-AD. En el Capítulo 3 de este trabajo de tesis doctoral se describe una alteración en la expresión del Calcium sensing receptor (CaSR) en el hipocampo de los ratones 3xTg-AD. Unos estudios realizados recientemente han demostrado la capacidad de los péptidos de β-amiloide de interaccionar y activar CaSR. Esta interacción induce la hiperproducción y secreción de la misma β-amiloide. Al mismo tiempo que se produce este mecanismo patogenético, CaSR resulta ser sobreexpresado. El análisis de la expresión de CaSR en el hipocampo de los ratones 3xTg-AD ha puesto de manifiesto su aumento en Cornu Ammonis 1 (CA1) y giro dentado (DG), consideradas áreas específicas implicadas en la acumulación temprana de β-amiloide y en la subsiguiente deposición de placas. En el Capítulo 4, el objeto de estudio es la expresión de las proteínas de unión al calcio, parvalbumina y calretinina en el hipocampo de los ratones 3xTg-AD de 18 meses de edad, teniendo en consideración la hipótesis concerniente a la alteración de la homeostasis del calcio en la patogénesis y progresión de la EA. Además, estas proteínas son frecuentemente utilizadas como marcadores de las diferentes subpoblaciónes de interneuronas inhibitorias gabaérgicas. En este estudio ha sido identificada una disminución en la densidad numérica (Nv) de las neuronas positivas para parvalbumina y calretinina en la region CA1 del hipocampo, la cual se corresponde con el área con mayor presencia de placas de β-amiloide. Este trabajo ha permitido la caracterización de una específica vulnerabilidad neuronal subestimada en la EA. Y por último, el Capítulo 5 se centra en el estudio de las alteraciones de los astrocitos positivos para S100β en los ratones 3xTg-AD, con la finalidad de estudiar una hipotesis adicional sobre la EA consistente en la denominada disfunción astrocitaria. Para ello, se ha analizado la Nv y las características morfológicas (superficie y volumen de la célula, de los procesos y del soma) de las células positivas para S100β en la corteza entorrinal de ratones desde 1 mes hasta los 18 meses de edad. A pesar de que la Nv ha resultado inalterada, cabe destacar un aumento general en los pérfiles positivos para S100β a 18 meses de edad, tanto en los ratones 3xTg-AD, como en los no transgénicos. Y un aumento todavía aún más significativo se ha podido apreciar en los ratones 3xTg-AD al compararlos con los no transgénicos. En conclusión, estos tres estudios destacan la necesidad de estudiar de manera más exhaustiva también otros mecanismos patogénicos que van más allá de la simple patología neuronal. Además, la caracterización detallada de los modelos animales como son los ratones 3xTg-AD utilizados en este trabajo de tesis doctoral es necesaria para poder obtener un conocimiento de base más profundo sobre las características patológicas que tienen lugar en ellos mismos, de tal manera que permitiera lograr una mejor planificación y comprensión de los resultados obtenidos de su utilización en las pruebas de nuevos medicamentos.
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Descrizione: Tesi di dottorato
Tipologia: Tesi di dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/961290
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