REGULATORY MECHANISMS CONTROLLING FLAVONOID AND VACUOLAR ACIDIFICATION PATHWAYS IN GRAPEVINE

In numerose specie di piante, un complesso regolativo denominato MBW in quanto costituito da un fattore di trascrizione del tipo MYB, uno della famiglia bHLH, ed una proteina regolatrice WD40, è alla base della regolazione ed iniziazione di numerosi processi di differenziazione cellulare. Nonostante le proteine della famiglia MYB siano le maggiori responsabili nel determinare la specificità del complesso MBW, regolatori intermedi possono essere richiesti per l'attivazione di uno specifico set di geni. In Arabidopsis il fattore di trascrizione del tipo WRKY TTG2, agisce a valle di uno specifico complesso regolativo MBW guidato dalla proteina MYB5 nella regolazione dello sviluppo di tricomi e nella produzione ed accumulo di proantocianidine e mucillagini nei semi (Johnson et al., 2002;. Ishida et al., 2007). In Petunia, un altro regolatore appartenente alla famiglia WRKY, PH3, agisce a valle e n coordinato con il complesso MBW guidato dalla proteina MYB PH4 nel controllo dell' acidificazione vacuolare nell'epidermide dei petali (Verweij et al., 2016). Tra i fattori di trascrizione di tipo MYB e WRKY di vite, MYB5a e MYB5b sono gli ortologhi di AtMYB5 e PhPH4, e WRKY26 è stato identificato come l'omologo più vicino a AtTTG2 e PhPH3 (Deluc et al, 2008;.. Wang et al, 2014, Verweij et al ., 2016). Abbiamo quindi ipotizzato che WRKY26 possa agire a valle del complesso MBW di vite che coinvolge MYB5a e MYB5b. In questo lavoro di tesi, abbiamo osservato un elevata correlazione tra i livelli di espressione di WRKY26 e MYB5a e mediante ibridazione in situ abbiamo dimostrato che questo due fattori co-localizzano in specifici tessuti cellulari di bacca. Abbiamo anche dimostrato che la regione promotrice di WRKY26 è altamente attivata dall'azione combinata di MYB5a e WRKY26, suggerendo che quest'ultimo possa non solo agire a valle di MYB5a, ma anche co-operare con il complesso MBW a cui MYB5a appartiene. Infine, testando la capacità del network MYB5a / MYB5b-WRKY26 proposto di attivare specifici geni, abbiamo dimostrato che WRKY26 potrebbe fornire maggiore variabilità ai processi controllati dall'emergente complesso regolativo. In particolar modo, i risultati ottenuti, suggeriscono che in vite MYB5a / MYB5b e WRKY26 possano agire in una rete di regolazione trascrizionale probabilmente conservata tra le specie vegetali e in grado di controllare sia l' acidificazione vacuolare che la via di biosintesi dei flavonoidi. Acidità e contenuto in flavonoidi svolgono in vite ruoli importanti nel determinare la qualità delle bacche e del vino; ulteriori analisi mirate a comprendere nel dettaglio i comuni meccanismi di regolazione sottostanti a queste caratterisctiche, potrebbero rappresentare un importante arrichimento nella possibilità di controllare la qualità finale della bacca ai fini di una buona vinificazione.

In a wide range of plants, a common regulatory complex composed by a MYB and a bHLH TF and a WD40 regulatory protein initiates multiple cellular differentiation pathways. Although the MYB proteins are the most responsible for complex specificity, other intermediate regulators could be required for the activation of a specific set of genes. In Arabidopsis the WRKY TF TTG2 is under the control of the regulatory complex driven by MYB5 in the regulation of trichome development and proanthocyanidin and mucilage production in seed coat (Johnson et al., 2002; Ishida et al., 2007). In Petunia, another regulator belonging to the WRKY family, PH3, acts down-stream and in concert with the MYB protein PH4-driven complex in the control of vacuolar acidification in petals epidermis (Verweij et al., 2016). Among grapevine MYB and WRKY TFs, MYB5a and MYB5b are both the orthologs to AtMYB5 and PhPH4, and WRKY26 has been identified as the closer homolog to AtTTG2 and PhPH3 (Deluc et al., 2008; Wang et al., 2014, Verweij et al., 2016). We therefore hypothesized that WRKY26 could be an intermediate regulator acting down-stream a regulatory complex involving MYB5a and MYB5b. In this work of thesis, we observed high correlation between WRKY26 and MYB5a expression and by in situ hybridization we demonstrated that they even co-localized in specific cell types in berry tissues. We also demonstrated that WRKY26 promoter region is highly activated by the combined action of MYB5a and WRKY26, suggesting that WRKY26 could acts down-stream MYB5a, but also in concert with the regulatory complex it belongs. Ultimately, testing the ability of the proposed MYB5a/MYB5b-WRKY26 network to activate specific target genes, we demonstrated that WRKY26 could provide more variability to the processes regulated by the aforementioned network. Above all, our results strongly suggest that in grapevine MYB5a/MYB5b and WRKY26 may act in a transcriptional regulatory network likely conserved among plant species and controlling both flavonoid and vacuolar acidification pathways. Flavonoids content and vacuolar acidity play important roles in grapevine in determining the quality of fruits and of wine and further investingation aimed to dissect common regulatory mechanisms controlling both these traits could represent an important advance in the possibility to control the final berry quality traits for winemaking.