Calcium sensors in plants: biochemical and biophysical study of Arabidopsis thaliana calmodulin-like proteins 14 and 36

Nelle piante Il calcio (Ca2+) regola una vasta gamma di risposte fisiologiche agli stimoli esterni. Oltre alla Calmodulina (CaM), altamente conservata, le piante possiedono una famiglia di 50 proteine calmodulin-like (CMLs), presente soltanto in esse, che gioca un ruolo importante nello sviluppo e nella risposta agli stress. Tuttavia, ad oggi, sono state determinate sperimentalmente le proprietà di poche CMLs. Il presente studio riporta una dettagliata caratterizzazione biochimica e biofisica in vitro di due proteine calmodulin-like ricombinanti, CML14 e CML36 di Arabidopsis thaliana, con lo scopo di chiarire se queste proteine abbiano le caratteristiche tipiche dei Ca2+ sensori. La proteina CML14 possiede tre motivi EF-hands di cui uno solo è predetto essere un sito di legame funzionale per il Ca2+, mentre nonostante la presenza di quattro motivi EF-hands, soltanto 3 di essi sono predetti essere funzionali nelle proteina CML36. Per analizzare la forza di legame del Ca2+ e del magnesio (Mg2+) alle proteine CML14 e CML36 abbiamo sfruttato la calorimetria di titolazione isotermica (ITC). Per valutare gli effetti del legame dei metalli sulla struttura e sui cambiamenti conformazionali delle due proteine abbiamo sfruttato la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), il dicroismo circolare (CD), la cromatografia di esclusione molecolare (SEC) e la fluorescenza sia intrinseca che basata su un fluoroforo estrinseco (ANS). Inoltre, per studiare la stabilità termica e locale di entrambe le proteine abbiamo sfruttato la calorimetria differenziale a scansione (DSC) e la proteolisi limitata. I nostri risultati hanno dimostrato che la proteina CML14 lega un solo ione Ca2+ con una affinità dell’ordine di micromolare (Kd ~ 12 µM), mentre la presenza del Mg2+ diminuisce l’affinità della proteina per il Ca2+ di circa 5 volte. Sebbene il legame del Ca2+ alla proteina aumenta la stabilità termica e locale, esso non induce né l’aumento dell’idrofobicità a livello della superficie della proteina né un grande riarrangiamento conformazionale. Tuttavia, Il legame del Ca2+ causa cambiamenti strutturali localizzati nell’unico EF-hand funzionale. Per quanto riguarda la proteina CML36, i nostri dati hanno rivelato che il Mg2+ e il Ca2+ inducono cambiamenti conformazionali della proteina significativi e differenti. In particolare, il legame del Ca2+ alla proteina aumenta la stabilità locale e in linea con una funzione di Ca2+ sensore, la proteina va incontro ad un aumento dell’idrofobicità di superficie in maniera dipendente dal Ca2+ ma non dal Mg2+. Inoltre, i nostri risultati ci hanno permesso di speculare che la proteina CML36 nella forma apo- è nello stato flessibile di molten globule. La proteina CML36 lega tre ioni Ca2+ in assenza di Mg2+ con un sito di legame ad alta affinità (Kd ̴ 0.7 µM) e due siti a bassa affinità (Kd ̴ 47 µM), e due ioni Ca2+ in presenza di Mg2+ (Kd1 ̴ 0,7 µM e Kd2 ̴ 5 µM). Questi dati suggeriscono che, in condizioni fisiologiche, Il Mg2+ è legato in maniera costitutiva ad un EF-hand mentre il Ca2+ si associa funzionalmente soltanto a due EF-hands. Considerati nell’insieme, i nostri risultati suggeriscono che la proteina CML14 non sembra avere le caratteristiche di un Ca2+ sensore classico e, in contrasto con una funzione controllata dall’esposizione delle regioni idrofobiche sulla superficie della proteina, indicano un ruolo diverso del Ca2+ nell’interazione di essa con un possibile target. Contrariamente la proteina CML36 mostra le caratteristiche tipiche di un Ca2+ sensore. In conclusione il nostro lavoro fornisce informazioni nuove ed interessanti sulle proprietà biochimiche delle proteine CML14 e CML36 di Arabidopsis che possono essere utilizzate per studi futuri allo scopo di chiarire il loro ruolo fisiologico preciso.

Calcium (Ca2+) regulates a wide range of physiological responses to external stimuli in plants. Besides conserved Calmodulins (CaMs), plants possess a unique family of 50 calmodulin-like proteins (CMLs) playing important roles in plant development and stress responses. However, to date, only the Ca2+ binding properties of few CMLs have been experimentally determined. The present study reports a detailed biochemical and biophysical in vitro characterization of two recombinant CMLs, namely, CML14 and CML36 from Arabidopsis thaliana, undertaken in order to clarify whether these proteins may be endowed with the typical features of the Ca2+ sensors. CML14 possesses three EF-hand motifs, but only one is predicted to be a functional Ca2+ binding site, whereas CML36 is predicted to have three functional Ca2+ binding sites despite the presence of four EF-hand motifs. We applied isothermal titration calorimetry (ITC) to analyse the energetics of Ca2+ and Mg2+ binding to CML14 and CML36. In addition nuclear magnetic resonance (NMR) and circular dichroism (CD) spectroscopy, size exclusion chromatography (SEC) were used together with intrinsic and ANS-based fluorescence, to evaluate the structural effects of metal binding and metal-induced conformational changes. Furthermore, differential scanning calorimetry (DSC) and limited proteolysis were used to characterize proteins thermal and local stability. Our results demonstrated that CML14 binds one Ca2+ ion with a micromolar affinity (Kd ~ 12 µM) while, the presence of Mg2+ decreases the Ca2+ affinity by ~ 5-fold. Although binding of Ca2+ to CML14 increased thermal and local stability, it does not result in a more hydrophobic protein surface and does not induce a large conformational rearrangement. However Ca2+ binding causes only localized structural changes in the unique functional EF-hand. Regarding the CML36 protein, our data revealed that the binding of Mg2+ and Ca2+ induce significant and distinct conformational changes throughout the protein. In particular, the binding of Ca2+ to CML36 increased the local stability and in line with a Ca2+ sensor function, the protein underwent a Ca2+- dependent increase in surface-exposed hydrophobicity while Mg2+ dependent effect was not noted. In addition, our findings enabled us to speculate on the apo- form of CML36 as a flexible molten globule state. CML36 binds three Ca2+ ions in the absence of Mg2+ with a high affinity binding site (Kd ~ 0.7 µM) and two lower affinity sites (Kd ~ 47 µM), and two Ca2+ ions in the presence of Mg2+ (Kd1 ~ 0.7 µM and Kd2 ~ 5 µM). These data suggest that, under physiological conditions, one EF-hand must be constitutively bound to Mg2+ while Ca2+ binds functionally only to two EF-hands. Together our results suggested that CML14 does not appear to be endowed with the characteristics of a classical Ca2+ sensor and, in contrast to the typical switch-like role controlled by protein exposure of the hydrophobic patches, indicate a different role of Ca2+ for target interactions of CML14. Instead CML36 showed the characteristics of a typical Ca2+ sensor. In conclusion our work provides new and interesting insights into the biochemical properties of Arabidopsis CML14 and CML36 that may be useful to future studies aimed at elucidating their precise physiological role.