MOLECULARLY IMPRINTED NANOPARTICLES FOR THE MEASUREMENT OF THE IRON REGULATOR HORMONE HEPCIDIN IN SERUM SAMPLES

L’epcidina è un ormone peptidico secreto principalmente dal fegato, organo di importanza primaria nella regolazione sistemica del ferro. Negli ultimi anni la quantificazione dell’epcidina ha acquisito un’importanza significativa sia per la diagnosi che per la prognosi di malattie umane correlate all’omeostasi del metabolismo del ferro. Nonostante ciò lo sviluppo di un saggio analitico affidabile e largamente applicabile per la quantificazione dell’epcidina nei fluidi biologici si è dimostrato estremamente difficoltoso; tanto che non è stata ancora individuata una soluzione che abbia incontrato il consenso generale. La presente tesi propone un metodo analitico per la quantificazione dell’epcidina 25, basato sull’utilizzo di nanoparticelle sintetiche in grado di riconoscere specificamente l’analita d’interesse. In particolare, questi nano-recettori sono stati sintetizzati sfruttando la tecnologia dei polimeri a stampo molecolare. I polimeri a stampo molecolare (MIP) sono materiali biomimetici capaci di legare un dato composto in modo specifico. Grazie alle loro peculiari caratteristiche, quali la capacità di riconoscimento molecolare, l’alta stabilità e resistenza e la facilità di sintesi, i MIP si sono dimostrati un’interessante alternativa all’uso degli anticorpi. Per questo motivo si è deciso di sintetizzare MIP in forma di nanoparticella per la “cattura” selettiva dell’epcidina. Nello specifico è stata prodotta una collezione di nanoparticelle capaci di legare l’epcidina 25. Il metodo base usato per la sintesi è la polimerizzazione per precipitazione, che ci ha permesso di ottenere nanoparticelle “stampate” in modo non-covalente. La collezione di nanoparticelle è stata interamente caratterizzata da un punto di vista fisico mediante diverse strategie: con esperimenti di diffusione dinamica della luce (DLS), per raccogliere informazioni sulle dimensioni e la monodispersità dei campioni; con esperimenti di diffusione statica della luce (SLS), per determinare il peso molecolare medio delle nanoparticelle; con microscopia a forza atomica (AFM) in aria, per investigare la morfologia dei diversi tipi di nanoparticella. In seguito si è passati all’analisi delle caratteristiche funzionali mediante risonanza plasmonica di superficie (SPR). Si è potuto così constatare che alcune formulazioni di MIP presentavano una buona affinità di legame per l’epcidina 25 umana rispetto a nanoparticelle di controllo non stampate molecolarmente (NIP). In particolare, le risposte SPR più significative sono state rilevate per tre differenti formulazioni di MIP caratterizzate da valori di Kd nanomolari, analogamente agli anticorpi monoclonali umani. E’ stato infine sviluppato un saggio per la quantificazione dei livelli di epcidina 25 nel siero basato sull’uso di MIP. Il saggio qui proposto è del tutto affine ai saggi di tipo immuno-assorbente legati ad un enzima (ELISA), ma con la sostituzione degli anticorpi con nanoparticelle MIP. Per sviluppare il saggio sono state considerate diverse variabili, quali la quantità di nanoparticelle da depositare per pozzetto nelle piastre da saggio, le soluzioni di lavaggio più adatte per la soppressione del segnale aspecifico, il tipo di saggio (diretto o competitivo), il tempo di risposta del saggio. Soluzioni di epcidina con concentrazioni tra 1 e 100 nM sono state utilizzate per determinare la risposta del saggio. Al fine di minimizzare il rumore di fondo del saggio è stato messo a punto un protocollo per il pretrattamento dei campioni reali, volto a ridurre l’interferenza di matrici complesse durante la quantificazione dell’analita. Nello specifico è stata ottimizzata la strategia di filtrazione del campione, così da minimizzare la deplezione dell’analita durante tale pretrattamento. Il saggio sviluppato, basato sull’uso di MIP, è stato infine impiegato per la quantificazione di epcidina 25 in campioni di siero, con risposte rilevabili nell’ambito di concentrazioni di interesse fisiologico (i.e. ≈ 1-100 nM). L’ampia diffusione di saggi simil-ELISA può potenzialmente essere favorita dall’uso di MIP come “anticorpi di plastica”, in quanto caratterizzati da interessanti proprietà, quali l’alta stabilità, la selettività, il basso costo e la semplicità procedurale di sintesi.

Hepcidin is a peptide hormone, mainly excreted by the liver, that was identified as the central systemic iron-regulator. The quantification of hepcidin gained significant importance in the past years for diagnostic and prognostic purposes concerning human diseases related to iron homeostasis. However the development of a reliable and broadly applicable assay for the assessment of hepcidin levels in biological fluids has proved to be very challenging and a general consensus solution for hepcidin determination is still missing. In the present thesis, a method for hepcidin 25 quantitation based on synthetic recognition nanoparticles (NPs) prepared via Molecularly Imprinted Polymer (MIP) technology is proposed. Molecularly imprinted polymers (MIPs) are biomimetic materials capable of specific recognition towards an analyte. Their molecular recognition properties, combined with their high stability, robustness, and easy synthesis, make MIPs extremely attractive as alternative to antibodies. For this reason, imprinted nanoparticles (MIP NPs) were synthesized for the selective capturing of hepcidin. During my PhD the synthesis of a library of MIP NPs for hepcidin 25 was performed, exploiting a non-covalent imprinting precipitation polymerization strategy. The NPs library was physically characterized using: Dynamic Light Scattering (DLS), to collect information about the size distribution and the sample monodispersity; Static Light Scattering (SLS), for measuring the averaged molecular weight (Mn) of the NPs; and Atomic Force Microscopy (AFM) in air, to investigate the morphology of our NPs batches. In a subsequent part of the work, the NP library was functionally characterized by Surface Plasmon Resonance (SPR). In fact, good affinity for human hepcidin 25 of MIP respect to control non-imprinted (NIP) polymer was estimated for some NP formulations by Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis. In particular the most significant SPR responses were found for three MIP batches exhibiting Kd values in the nanomolar range, in similarity with the Kds of natural monoclonal antibodies. In the last part of the PhD thesis, the development of an ELISA like MIP-based assay for the assessment of the hepcidin 25 levels in serum was approached. Variables, such as the quantity of NPs deposited per microtiter plate well, the most suitable solution to quench the aspecific binding, the competitive or direct format of assay, the time of response of the assay, were evaluated. The response of the ELISA like assay with model hepcidin solutions was evaluated in the range 1-100nM. In order to diminish the background noise of the assay, a protocol for real sample pre-treatment was set up. In particular, a filtration strategy to avoid hepcidin depletion from samples after filtration was optimized. This method allowed the clean-up of real samples in order to minimize the interference of complex matrixes during the analyte quantification. Finally, the developed ELISA like MIP-based assay for hepcidin 25 level assessments in serum was approached with resulting responses within the range of concentrations of physiological interest, i.e. ≈ 1-100 nM. The possibility of using MIPs as plastic antibodies in ELISA-like assays has the advantage of a potential widespread diffusion thanks to their high stability, selectivity, low cost and simple manufacture procedure.