Bacteria facing chalchogens: biogenic formation of Se and Te nanoparticles and evaluation of their antimicrobial potential

I calcogenuri selenio e tellurio possono essere presenti in tracce nell'ambiente. I due elementi sono insolubili in acqua e privi di tossicità nella loro forma elementale (Se0 e Te0), mentre gli ossianioni selenito (SeO32-) e tellurito (TeO32-) sono solubili in acqua e tossici per gli organismi. La tossicità di questi ossianioni è dovuta alla loro attività ossidante che può interferire con le funzione cellulari fondamentali. I batteri hanno sviluppato diversi meccanismi per la trasformazione di forme metalliche ossianioniche a forme non tossiche. Infatti, diversi ceppi batterici hanno evidenziato la capacità di ridurre selenito a selenio elementale in diverse condizioni, con la conseguente formazione di nanoparticelle con diverse morfologie, sia all'interno che all'esterno della cellula microbica. Similarmente, la riduzione di tellurito a tellurio elementale è stata osservata in differenti frazioni cellulari di diverse specie batteriche. Questi aspetti sono particolarmente interessante dal momento che il recente sviluppo delle nanotecnologie ha attirato un crescente interesse nello sfruttamento dell'abilità naturale dei sistemi biologici di produrre nanoparticelle con proprietà definite sia nel citoplasma che nello spazio extracellulare. Questo processo può essere infatti considerato come un'alternativa economica ed ecosostenibile ai tradizionali metodi chimici e fisici di sintesi. Nel presente progetto di dottorato è stata valutata sia la possibilità di utilizzare isolati batterici per produrre nanoparticelle di selenio e tellurio che la possibile applicazione di questi nanomateriali. Nella prima parte della tesi è stato analizzato il meccanismo coinvolto nella formazione di nanoparticelle biogeniche in diversi ceppi batterici. In particolare, la riduzione del selenito a selenio elementale è stata valutata nei ceppi Stenotrophomonas maltophilia SeITE02, Bacillus mycoides SeITE01, mentre la riduzione di selenito e tellurito è stata analizzata nel ceppo Ochrobactrum sp. MPV1. Sulla base dei dati discussi nel presente lavoro di tesi, è stato evidenziato sia il coinvolgimento di composti contenenti gruppi tiolici (glutatione per Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 e Ochrobactrum sp. MPV1, bacillo-tioli per Bacillus mycoides SeITE01) che di enzimi intra o extracellulari. D'altro canto, la riduzione del tellurito da parte di Ochrobactrum sp. MPV1 può essere legata all'attività riduttiva di enzimi intracellulari NADH dipendenti, i quali evidenziano un meccanismo di riduzione diverso da quello responsabile per la riduzione del selenito. Nella seconda parte della tesi, le proprietà chimico-fisiche delle nanoparticelle biogeniche prodotte da questi ceppi batterici sono state studiate. SeNPs biogeniche hanno evidenziato dimensioni simili (dipendenti dal tempo di incubazione) ed elevata stabilità (potenziale Z negativo). Anche le TeNPs estratte da Ochrobactrum sp. MPV1 hanno rivelato elevata stabilità (potenziale Z positivo). E' stata inoltre studiata l'attività antibatterica di queste nanoparticelle biogeniche contro ceppi di riferimento. SeNPs hanno evidenziato attività antibatterica a concentrazioni basse. L'effetto tossico di queste nanoparticlle può essere correlato alla produzione di specie reattive dell'ossigeno dopo l'esposizione alla coltura batterica. I dati raccolti fino ad ora suggeriscono che l'attività antibatterica sembra essere strettamente correlata alle dimensioni delle nanoparticelle: è stato infatti osservato che la più alta attività è stata mostrata dalle nanoparticelle di dimensioni inferiori. E' importante notare, in particolare, che batteri cresciuti sottoforma di biofilm hanno evidenziato una tolleranza simile a quella evidenziata dalle colture planktoniche. Sono stati inoltre effettuati test comparativi mirati all'analisi dell'attività antibatterica di nanoparticelle di selenio estratte da due ceppi microbici differenti, Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 e Bacillus mycoides SeITE01. Queste nanoparticelle biogeniche hanno evidenziato un potenziale antimicrobico più elevato di quello esibito da nanoparticelle di selenio sintetizzate chimicamente. Infine, è stata misurata su fibroblasti umani e cellule dendritiche sia la tossicità che l'induzione della produzione di citochine da parte di questi nanomateriali: questi esperimenti hanno evidenziato l'assenza di tossicità e induzione di produzione di citochine solo a concentrazioni molto elevate (250 e 500 mg/L). Tutti questi risultati aprono alla prospettiva di un possibile sfruttamento di nanoparticelle di selenio e tellurio come efficati agenti antimicrobici con un'elevato potere di eradicazione di biofilm.

The chalcogens selenium and tellurium can be found as trace elements in the environment. Selenium and tellurium in their elemental form (i.e. Se0 and Te0) are insoluble in water and almost non-toxic, while the oxyanions selenite (SeO32-) and tellurite (TeO32-) are highly soluble in water and toxic to biological systems. The toxicity of these oxyanions has been ascribed to their oxidizing activity, which can interfere with fundamental cellular functions. Bacteria have developed different mechanisms for the transformation of metal oxyanions to non-toxic forms. In fact, a number of bacterial strains has revealed the capacity to reduce selenite to elemental selenium in different conditions, with formation of nanoparticles with various morphological characteristics, either inside the cells or extracellularly. Similarly, tellurite reduction to elemental tellurium nanoparticles has been reported in different cellular compartments within a wide range of bacterial species. This appears particularly worth of note since the recent boost of nanotechnology has attracted growing interest in the exploitation of the natural ability of biological systems to generate nanomaterial with well-defined properties both in the cytoplasm and outside the bacterial cells. Indeed, this can be considered as a green and ecofriendly alternative to the chemical and physical methods conventionally used to synthesize nanomaterials. In the present PhD work, the utilization of bacterial strains to produce selenium and tellurium nanoparticles along with the possible applications of these biogenic nanomaterials have been evaluated. In the first part of this dissertation, the mechanisms involved in the biogenic formation of nanoparticles by different microbial isolates have been analyzed. In particular, the reduction of selenite to elemental selenium nanoparticles has been studied in Stenotrophomonas maltophilia SeITE02, Bacillus mycoides SeITE01, while the reduction of both selenite and tellurite has been evaluated in Ochrobactrum sp. MPV1. On the basis of the evidences discussed in this thesis, the involvement of both thiolic compounds (glutathione for Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 and Ochrobactrum sp. MPV1, bacillithiols for Bacillus mycoides SeITE01) and intracellular/extracellular enzymes can be singled out. On the other hand, tellurite reduction in Ochrobactrum sp. MPV1 may be attributed to the activity of an intracellular NADH-dependent enzyme, exhibiting a reducing mechanism different from that involved in selenite reduction. In the second part of the dissertation, biogenic nanomaterials produced by the microbial strains of interest are characterized in terms of physico-chemical parameters as well as for their biological activity. Biogenic SeNPs showed similar sizes (dependent on incubation time) and high stability (negative ζ-potential). In this respect, also biogenic TeNPs from Ochrobactrum sp. MPV1 revealed a high stability (positive ζ-potential). Moreover, the antimicrobial potential of these biogenic nanomaterials has been investigated against reference strains. In particular, Se0 nanoparticles exhibited antimicrobial activity at quite low concentrations. Toxic effects of both Se0 and Te0 nanoparticles can be related to the production of reactive oxygen species upon exposure of the bacterial cultures. Evidence so far achieved suggests that the antimicrobial activity seems to be strictly linked to the dimensions of the nanoparticles: indeed, the highest activity was shown by nanoparticles of smaller sizes. In particular, it is worth noting that bacteria tested in biofilm mode of growth responded to the treatment by Se0 and Te0 nanoparticles with a susceptibility similar to that observed in planktonic cultures. Comparative tests were also performed with biogenic SeNPs extracted from two different bacterial strains, namely Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 and Bacillus mycoides SeITE01. These biogenic nanoparticles showed a higher antimicrobial potential than exerted by the chemically synthesized ones. Finally, toxicity and induction of cytokine production by these nanomaterials were tested on human fibroblasts and dendritic cells, evidencing on the one hand no toxic effects, while on the other induction of cytokine production only at high concentrations (250 and 500 mg/L). All these results open the perspective of a possible exploitation of both Se0 and Te0 nanoparticles as efficacious antimicrobial agents with a remarkable biofilm eradication capacity.