Pancreatic cancer stem cell characterization and study of the microenvironment impact on their biological features.

E’ stato dimostrato che le cellule staminali tumorali (cancer stem cells, CSC) sono responsabili dello sviluppo neoplastico, della formazione delle metastasi, della resistenza al trattamento con chemioterapici e dello sviluppo di recidive. Inoltre, il microambiente tumorale dell’adenocarcinoma pancreatico duttale (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) è ricco di matrice extracellulare, la quale promuove la crescita tumorale e la resistenza alle terapie. Lo scopo di questa tesi è stato l’ottenimento e la successiva caratterizzazione di CSC da linee cellulari di PDAC. Le CSC di PDAC si sono rivelate generalmente più resistenti all’azione di cinque farmaci chemioterapici rispetto alle cellule parentali e hanno mostrato un’aumentata espressione dei marcatori staminali EpCAM e CD44v6 e una diminuita espressione del marcatore epiteliale E-caderina. Inoltre, esse hanno mostrato maggiori capacità tumorigeniche e metastatiche rispetto alle cellule parentali quando inoculate in topi nudi atimici. Quando coltivate su diverse matrici in modelli tridimensionali (3D), le CSC di PDAC e le cellule parentali hanno acquisito una diversa morfologia. In particolare, solo le CSC hanno sviluppato strutture tubulari in presenza di Matrigel e hanno mostrato un aumento dell’espressione dei marcatori endoteliali CD34, CD31 e CD144 e dei fattori pro-angiogenici IGFBP1 ed eNOS. Inoltre, le CSC hanno mostrato un profilo angiogenico superiore rispetto alle cellule parentali, come dimostrato dalla secrezione di diversi fattori pro-angiogenici. Quando inoculate in topi nudi, le CSC hanno sviluppato tumori con una rete vascolare più intensa e con vasi di calibro maggiore rispetto ai tumori generati dalle cellule parentali. Infine, quando direttamente coltivate con cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSC) del microambiente tumorale, le cellule di PDAC hanno mostrato una diminuita espressione dei marcatori staminali EpCAM e CD24. Nel complesso questi risultati dimostrano che da linee cellulari di PDAC è possibile derivare CSC con caratteristiche tumorali clinicamente rilevanti che costituiscono un modello necessario per lo studio della biologia del PDAC. I modelli 3D sono di cruciale importanza per lo studio sia del ruolo del microambiente nella biologia del tumore sia della capacità delle CSC di PDAC di formare nuovi vasi nelle fasi iniziali dello sviluppo tumorale. Infine, le BM-MSC possono avere un ruolo nella regolazione del differenziamento cellulare nel PDAC.

It has been reported that cancer stem cells (CSCs) are responsible for tumor initiation, metastasis, chemoresistance, and relapse. Furthermore, the tumor microenvironment of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is rich of extracellular matrix (ECM), which supports tumor growth and chemotherapy resistance. The aim of this thesis was to obtain and characterize CSCs derived from PDAC established cell lines. PDAC CSCs were generally more resistant to the action of five anti-cancer drugs than parental cell lines and were characterized by an increased expression of the stem cell markers EpCAM and CD44v6, and a decreased expression of the epithelial state marker E-cadherin. Furthermore, PDAC CSCs were more tumorigenic and possessed a higher metastatic activity than parental cells when injected into nude mice. When cultured on the top of several matrices, CSCs and the parental cells acquired a different morphology. In particular, only CSCs developed tube-like structures in the presence of Matrigel, and showed an increased expression of the endothelial cell markers CD34, CD31, and CD144, and of the pro-angiogenic factors IGFBP1 and eNOS. Furthermore, PDAC CSCs demonstrated a higher angiogenic profile with respect to the parental cells, as demonstrated by the secretion of several pro-angiogenic factors. When injected into nude mice, PDAC CSCs gave rise to tumors with a more intense vascular network with vessels with larger caliper than the tumors generated by parental cells. Additionally, when directly co-cultured with microenvironment bone marrow-mesenchymal stem cells (BM-MSCs), PDAC cells showed a decreased expression of the stem cell markers EpCAM and CD24. Taken together these results demonstrate that CSCs derived from PDAC cell lines possess all the characteristics of the clinically relevant tumor, rendering them a model to deeply understand PDAC biology. Three-dimensional cell culture models are of crucial relevance to study the role of the microenvironment on tumor biology and of the capability of PDAC CSCs for the sprouting of new vessels at the initial phases of tumor development. Finally, BM-MSCs may play a role in the regulation of PDAC cellular differentiation.