La Leucemia Mieloide Cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa caratterizzata dalla presenza di BCR-ABL1, una tirosin chinasi coinvolta nell’attivazione aberrante di vie molecolari responsabili dei processi di carcinogenesi legati a questa malattia. PTPRG (tirosin fosfatasi recettoriale gamma) è un gene onco soppressore la cui espressione nella Leucemia Mieloide Cronica è negativamente regolata dall’ipermetilazione del suo promotore. Studi precedenti hanno dimostrato che l’espressione indotta della proteina PTPRG è correlata ad una ridotta formazione di colonie ed ad una diminuita capacità clonogenica delle cellule leucemiche. Inoltre, un ripristino della sua espressione è stato osservato nei pazienti dopo la terapia con inibitori specifici contro le tirosin chinasi. Al fine di comprendere la regolazione reciproca tra questa fosfatasi e BCR-ABL1, abbiamo cercato possibili interattori molecolari per PTPRG tra le proteine appartenenti a vie molecolari attivate da BCR-ABL1 e ci siamo concentrati sullo studio della proteina β-Catenina (CTNNB1), che rappresenta allo stesso tempo un target di PTPRG ed un suo regolatore trascrizionale. Abbiamo osservato che una modulazione di espressione e funzione di PTPRG in linee cellulari di CML porta a cambiamenti nella fosforilazione e nell'attivazione di BCR-ABL1 e della β-Catenina: PTPRG è in grado di legare e defosforilare l'onco-proteina β-Catenina provocando la sua destabilizzazione nell’ambiente citosolico con conseguente proteolisi in cellule con una espressione esogena o endogena di PTPRG (linee cellulari K562 e LAMA-84). Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attività trascrizionale della β-Catenina in linee cellulari che non esprimono PTPRG provoca un’aumentata espressione del gene DNA (citosina-5) –metiltransferasi 1 (DNMT1), responsabile dell’ipermetilazione del promotore di PTPRG, e che il blocco della sua attività dopo il trattamento con un inibitore delle metiltransferasi (Azacitidina) ed il silenziamento di questo gene con uno specifico siRNA sono correlati ad una ripristinata espressione di PTPRG, sia a livello trascrizionale che proteico. In questo progetto dimostriamo per la prima volta un meccanismo che coinvolge la degradazione della β-Catenina, mediata dalla defosforilazione ad opera della fosfatasi PTPRG, e la conseguente inibizione trascrizionale dei geni regolati dal complesso di trascrizione TCF4 / β-Catenina. Da parte sua, anche la β-Catenina regola PTPRG dal momento che è in grado di attivare la trascrizione di DNMT1, che contribuisce alla metilazione del promotore di PTPRG, impedendone la corretta trascrizione. Abbiamo ipotizzato l’esistenza di un loop regolativo tra PTPRG e la β-Catenina dimostrando che uno squilibrio del sistema a favore di una o l'altra potrebbe determinare un diverso destino proliferativo per le cellule di Leucemia Mieloide Cronica e per la loro aggressività clinica.

Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a myeloproliferative disease characterized by the presence of BCR-ABL1 tyrosine kinase. PTPRG (Protein Tyrosine Phoshatase Receptor type γ) is a tumor suppressor gene down-regulated by hypermethylation of its promoter region in CML. Previous studies demonstrated that a re-expression of PTPRG protein is correlated with a decreased colony formation and clonogenic capability of CML cells. In addition, its restored expression was observed in patients after TKI therapy. In order to understand the mutual regulation between this phosphatase and BCR-ABL1, we searched for PTPRG putative interactors among proteins that are downstream BCR-ABL1 driven pathways and we focused on β-Catenin (CTNNB1), that resulted at the same time a PTPRG substrate and its transcriptional regulator. We observed that a modulation of expression and function of PTPRG in CML cell lines leads to changes in phosphorylation and activation of BCR-ABL1 and β-Catenin: PTPRG is able to bind and dephosphorylate the onco-protein β-Catenin causing its cytosolic destabilization and consequent degradation in cells with an exogenous or endogenous expression of PTPRG (K562 and LAMA-84 cell lines). Furthermore, we demonstrated that an increased expression of β-Catenin in PTPRG negative CML cell lines is correlated with an over-expression of the DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1) that is responsible of PTPRG promoter hypermethylation and that inhibition after treatment with 5-Azacydine and down-regulation of this gene are correlated with PTPRG re-expression both at mRNA and protein levels. Here we show for the first time a mechanism that involves β-Catenin degradation and the consequent down-regulation of genes regulated by the TCF4/β-Catenin transcription complex. In return, β-Catenin up-regulation is correlated with an over-expression of DNMT1 that contributes to hypermethylation of PTPRG promoter region. We hypothesized that there is a regulative loop between PTPRG and β-Catenin and that an imbalance of the system in favor of one or the other could determine a different proliferation fate of CML cells and their clinical aggressiveness.

Regulative loop between β-Catenin and Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type γ (PTPRG) in Chronic Myeloid Leukemia

Tomasello, Luisa
2016-01-01

Abstract

Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a myeloproliferative disease characterized by the presence of BCR-ABL1 tyrosine kinase. PTPRG (Protein Tyrosine Phoshatase Receptor type γ) is a tumor suppressor gene down-regulated by hypermethylation of its promoter region in CML. Previous studies demonstrated that a re-expression of PTPRG protein is correlated with a decreased colony formation and clonogenic capability of CML cells. In addition, its restored expression was observed in patients after TKI therapy. In order to understand the mutual regulation between this phosphatase and BCR-ABL1, we searched for PTPRG putative interactors among proteins that are downstream BCR-ABL1 driven pathways and we focused on β-Catenin (CTNNB1), that resulted at the same time a PTPRG substrate and its transcriptional regulator. We observed that a modulation of expression and function of PTPRG in CML cell lines leads to changes in phosphorylation and activation of BCR-ABL1 and β-Catenin: PTPRG is able to bind and dephosphorylate the onco-protein β-Catenin causing its cytosolic destabilization and consequent degradation in cells with an exogenous or endogenous expression of PTPRG (K562 and LAMA-84 cell lines). Furthermore, we demonstrated that an increased expression of β-Catenin in PTPRG negative CML cell lines is correlated with an over-expression of the DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1) that is responsible of PTPRG promoter hypermethylation and that inhibition after treatment with 5-Azacydine and down-regulation of this gene are correlated with PTPRG re-expression both at mRNA and protein levels. Here we show for the first time a mechanism that involves β-Catenin degradation and the consequent down-regulation of genes regulated by the TCF4/β-Catenin transcription complex. In return, β-Catenin up-regulation is correlated with an over-expression of DNMT1 that contributes to hypermethylation of PTPRG promoter region. We hypothesized that there is a regulative loop between PTPRG and β-Catenin and that an imbalance of the system in favor of one or the other could determine a different proliferation fate of CML cells and their clinical aggressiveness.
2016
Leucemia Mieloide Cronica, PTPRG, Beta Catenina, onco soppressore, pathway molecolare
La Leucemia Mieloide Cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa caratterizzata dalla presenza di BCR-ABL1, una tirosin chinasi coinvolta nell’attivazione aberrante di vie molecolari responsabili dei processi di carcinogenesi legati a questa malattia. PTPRG (tirosin fosfatasi recettoriale gamma) è un gene onco soppressore la cui espressione nella Leucemia Mieloide Cronica è negativamente regolata dall’ipermetilazione del suo promotore. Studi precedenti hanno dimostrato che l’espressione indotta della proteina PTPRG è correlata ad una ridotta formazione di colonie ed ad una diminuita capacità clonogenica delle cellule leucemiche. Inoltre, un ripristino della sua espressione è stato osservato nei pazienti dopo la terapia con inibitori specifici contro le tirosin chinasi. Al fine di comprendere la regolazione reciproca tra questa fosfatasi e BCR-ABL1, abbiamo cercato possibili interattori molecolari per PTPRG tra le proteine appartenenti a vie molecolari attivate da BCR-ABL1 e ci siamo concentrati sullo studio della proteina β-Catenina (CTNNB1), che rappresenta allo stesso tempo un target di PTPRG ed un suo regolatore trascrizionale. Abbiamo osservato che una modulazione di espressione e funzione di PTPRG in linee cellulari di CML porta a cambiamenti nella fosforilazione e nell'attivazione di BCR-ABL1 e della β-Catenina: PTPRG è in grado di legare e defosforilare l'onco-proteina β-Catenina provocando la sua destabilizzazione nell’ambiente citosolico con conseguente proteolisi in cellule con una espressione esogena o endogena di PTPRG (linee cellulari K562 e LAMA-84). Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attività trascrizionale della β-Catenina in linee cellulari che non esprimono PTPRG provoca un’aumentata espressione del gene DNA (citosina-5) –metiltransferasi 1 (DNMT1), responsabile dell’ipermetilazione del promotore di PTPRG, e che il blocco della sua attività dopo il trattamento con un inibitore delle metiltransferasi (Azacitidina) ed il silenziamento di questo gene con uno specifico siRNA sono correlati ad una ripristinata espressione di PTPRG, sia a livello trascrizionale che proteico. In questo progetto dimostriamo per la prima volta un meccanismo che coinvolge la degradazione della β-Catenina, mediata dalla defosforilazione ad opera della fosfatasi PTPRG, e la conseguente inibizione trascrizionale dei geni regolati dal complesso di trascrizione TCF4 / β-Catenina. Da parte sua, anche la β-Catenina regola PTPRG dal momento che è in grado di attivare la trascrizione di DNMT1, che contribuisce alla metilazione del promotore di PTPRG, impedendone la corretta trascrizione. Abbiamo ipotizzato l’esistenza di un loop regolativo tra PTPRG e la β-Catenina dimostrando che uno squilibrio del sistema a favore di una o l'altra potrebbe determinare un diverso destino proliferativo per le cellule di Leucemia Mieloide Cronica e per la loro aggressività clinica.
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tesi dottorato Luisa Tomasello

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Descrizione: Regulative loop between β-Catenin and Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type γ (PTPRG) in Chronic Myeloid Leukemia
Tipologia: Tesi di dottorato
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