Sleep and infections

L’organismo è costantemente esposto all’aggressione di patogeni che causano infezioni acute e/o croniche. La sonnolenza (ipersonnia) è un sintomo comune nel corso di infezioni, come componente del cosiddetto "sickness behavior" (“comportamento di malattia”), mirato a facilitare la guarigione. Alterazioni del sonno, della veglia e della loro alternanza possono, tuttavia, avere caratteristiche specifiche nel corso di determinate infezioni. E’ questo il caso delle infezioni causate dal parassita Trypanosoma brucei, l’agente eziologico della tripanosomiasi africana o malattia del sonno. Nel corso di tale patologia sono state infatti documentate, sia nell’uomo che in modelli sperimentali in roditori, alterazioni del ritmo sonno-veglia e della struttura del sonno, incluse alterazioni neurofisiologiche di tipo narcolettico. D’altro canto, è stato recentemente riportato, in vari paesi, un aumento di narcolessia, una rara patologia del sonno, in seguito a epidemie influenzali e tale aumento è stato ascritto a meccanismi autoimmunitari. In questa tesi di dottorato sono stati utilizzati modelli murini di infezione del virus influenzale H1N1 e del parassita Trypanosoma brucei allo scopo di indagare e verificare aspetti patogenetici, circuiti neuronali e mediatori infiammatori coinvolti nelle alterazioni del sonno e della veglia in queste malattie. L’infezione influenzale ha costituito l’oggetto del primo studio presentato nella tesi. In particolare, la sperimentazione è stata mirata a verificare se il virus influenzale H1N1 potesse causare di per sé alterazioni di tipo narcolettico in assenza di risposte autoimmuni. A tale scopo, è stata adottata un’instillazione nasale (che mima l’infezione naturale per via aerea) del ceppo virale murino di influenza A (A/WSN/33) in topi Rag1-/-, privi di risposta immunitaria adattativa. Va qui ricordato che, in condizioni fisiologiche, il sonno è caratterizzato da un'alternanza ciclica di fasi non-REM (NREM) e REM. Nel modello murino di infezione influenzale qui indagato sono stati osservati, nel corso della quarta settimana di infezione, una frammentazione delle fasi di sonno e di veglia, così come alterazioni della sequenza del sonno NREM-sonno REM rappresentate da episodi “sleep-onset REM” (SOREM). Negli episodi SOREM il sonno REM è preceduto da un periodo di veglia invece che da un periodo di sonno NREM. Con metodiche di biologia molecolare, è stata, inoltre, documentata nell’encefalo, in seguito all’infezione, una “up-regolazione” di trascritti codificanti per mediatori pro-infiammatori. A livello cellulare, analisi immunoistochimiche mirate a identificare la localizzazione dell’antigene virale hanno rivelato che dalla cavità nasale (e, in particolare, dalla mucosa olfattiva) il virus aveva infettato il bulbo olfattivo, e da lì, presumibilmente in seguito a trasporto assonale retrogrado, neuroni in varie regioni encefaliche collegate al bulbo olfattivo. Fra questi, sono stati identificati neuroni infetti nell'ipotalamo e nel tronco encefalico, in gruppi neuronali coinvolti nella regolazione del sonno e della veglia. In particolare, nell’ipotalamo, è stato osservato, con metodiche di doppia immunofluorescenza, che il virus aveva infettato neuroni dell’ipotalamo laterale contenenti il peptide orexina/ipocretina. Questa osservazione è di particolare interesse poiché è ben documentato che i neuroni orexinergici giocano, in condizioni normali, un ruolo chiave nel mantenimento di un periodo stabile di veglia e nelle transizioni fra il sonno e la veglia e fra il sonno REM e il sonno NREM. Va, inoltre, ricordato, che i neuroni orexinergici vanno incontro a degenerazione, nell’uomo, nella narcolessia con cataplessia. Nel loro complesso, i dati sperimentali qui presentati hanno dimostrato alterazioni di tipo narcolettico nel corso di infezione influenzale e in assenza di risposte autoimmuni, richiamando l’attenzione su possibili effetti diretti dell’infezione in soggetti geneticamente predisposti. L’esistenza di proiezioni monosinaptiche di neuroni ipotalamici orexinergici al bulbo olfattivo è stata, quindi, verificata nel secondo studio sperimentale della tesi. A tal fine, è stato utilizzato un tracciante fluorescente che viene trasportato lungo gli assoni in via retrograda, il Fluoro-Gold. Il fenotipo orexinergico di una parte dei neuroni marcati in via retrograda dal tracciante nell’ipotalamo è stato verificato con metodiche di doppia marcatura. Con questo approccio metodologico è stata così dimostrata, per la prima volta, l’esistenza di una proiezione diretta dei neuroni orexinergici al bulbo olfattivo. Tale via neurale può, quindi, venire utilizzata da patogeni e agenti tossici ambientali per raggiungere centri ipotalamici che svolgono un ruolo chiave nella regolazione del sonno e della veglia. Il terzo studio della tesi si è focalizzato sulla tripanosomiasi africana. Sia nell’uomo che nell’animale da esperimento l’infezione evolve in due stadi: un primo stadio emolinfatico, seguito da uno stadio meningo-encefalitico quando il parassita invade il sistema nervoso centrale attraversando la barriera emato-encefalica. La determinazione dello stadio della malattia, che è fatale se non curata, ha importanti implicazioni terapeutiche. Tuttavia, i criteri attualmente in uso per la diagnosi di stadio non sono sufficientemente sensibili e sono oggetto di molte critiche. Lo studio sperimentale qui presentato era mirato alla verifica di due potenziali biomarcatori dell’inizio del secondo stadio della malattia: i livelli liquorali della chemochina CXCL10 e le alterazioni del sonno e della veglia. In ratti infettati con il parassita Trypanosoma brucei brucei, il primo parametro è stato indagato mediante ELISA su campioni di siero e liquor e il secondo parametro mediante registrazione neurofisiologica continua con telemetria. I risultati dello studio, focalizzati sull’intervallo temporale durante il quale il parassita inizia ad invadere il parenchima encefalico, hanno dimostrato un picco dei livelli di CXCL10 nel siero durante la “neuroinvasione” iniziale ed un picco liquorale nella fase immediatamente successiva della malattia. I dati neurofisiologici hanno dimostrato una frammentazione progressiva delle fasi di veglia e di sonno, con un’iniziale “inversione di fase” (invasione del periodo di sonno da parte della veglia) in corrispondenza temporale con l’attraversamento della barriera emato-encefalica da parte del parassita. I dati hanno, quindi, indicato alterazioni significative del sonno e della veglia all’inizio della fase encefalitica della tripanosomiasi africana, con un rialzo dei livelli liquorali di CXCL10 durante l’evoluzione del secondo stadio della malattia.

The human body is constantly exposed to the attacks of pathogens which can trigger acute or chronic infections. When this occurs, the general common feeling is a need to sleep. Such somnolence is a component of the so-called sickness syndrome or sickness behavior, which facilitates recovery. However, changes in the sleep-wake pattern may show distinct features during different infections. Marked changes in the sleep-wake pattern, including narcolepsy-like neurophysiological alterations, have been observed following infection with the parasites African trypanosomes. Interestingly, infection with influenza virus has been recently associated with narcolepsy as well. In this doctoral thesis, rodent models of H1N1 influenza A virus infection and African trypanosomiasis were used to investigate the sleep-wake pattern, related neural circuitry and inflammatory mediators. The first investigation (which has been published) was focused on influenza infection. In particular, Rag1-/- mice, which lack adaptive immunity, were used to verify whether a mouse-neuroadapted influenza A virus (A/WSN/33) could cause per se narcoleptic-like changes following intranasal instillation. In the normal sleep structure, rapid eye movement (REM) sleep is preceded by NREM sleep in cyclic sequences. During the fourth we postinfection, a fragmented sleep-wake pattern and alterations of the NREM-REM sleep sequence, with the occurrence of so-called sleep-onset REM (SOREM) episodes, were observed in the murine model of influenza infection. In SOREM episodes, REM sleep is preceded by wake and therefore the NREM-REM sleep sequence is disrupted. Interestingly, immunohistochemistry for A/WSN/33 virus antigens showed in the infected mice hypothalamic and upper brainstem localization, which included subsets of sleep-wake-regulatory neurons. Moreover, upregulation of transcripts encoding pro-inflammatory mediators was seen in the brain of the infected Rag1-/- mice. Our findings thus showed that infection with influenza virus can lead to narcoleptic-like sleep-wake alterations in genetically susceptible subjects. Since the distribution in the brain of influenza virus after intranasal instillation seemed to reflect retrograde axonal transport from the olfactory bulb, the second experiment was focused on the verification of this monosynaptic connection. Unilateral injection of the fluorescent tracer Fluoro-Gold into the olfactory bulb in mice showed that neuronal cell bodies containing orexin/hypocretin, which are located in the lateral hypothalamus, were retrogradely labelled. The findings thus showed that these peptidergic neurons, which play a key role in wakefulness stability and sleep-wake transitions, project directly the olfactory bulb. The third experimental data set was focused on African trypanosomiasis. Staging of this disease is currently based on criteria that lack sensitivity. Since disease staging is needed for effective treatment of the patients, the study was aimed at the investigation of two potential biomarkers of the disease (sleep-wake alterations and levels of the chemokine CXCL10 in the cerebrospinal fluid) at the time of parasite invasion of the brain parenchyma. Sleep-wake changes characterize African trypanosomiasis in humans and in rodent models. The chemokine CXCL10 was previously found to play a key pathogenetic role in parasite neuroinvasion. Trypanosoma brucei brucei-infected rats were used as animal model. Interestingly, CXCL10 levels showed a steep increase in the serum at the time of parasite neuroinvasion and in the cerebrospinal fluid later during the disease. Neurophysiological long-term recordings indicated a progressive sleep-wake fragmentation and invasion of sleep by wakefulness at the time of parasite neuroinvasion.