IN VITRO AND IN VIVO EFFECT OF SYK INHIBITORS AS A NEW ANTIMALARIAL DRUGS

Le terapie combinate basate sull’artemisinina rappresentano il trattamento più efficace nel curare la malaria non complicata causata dal Plasmodium falciparum; tuttavia, è stata rilevata resistenza all’artemisinina in alcune aree del sud-est asiatico. Pertanto, lo sviluppo di nuovi farmaci antimalarici rappresenta uno degli principali obiettivi. Durante il ciclo intraeritrocitario del Plasmodio, la banda 3 viene fosforilata ad opera della chinasi Syk, inducendo la vescicolazione della membrana ed il suo successivo indebolimento. L’inibizione di Syk sembrerebbe interferire su questi meccanismi e sulla capacità del parassita di infettare nuove eritrociti. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di indagare gli effetti degli inibitori di Syk come un nuovo farmaco antimalarico, in vivo ed in vitro, e di valutare l'efficacia della attuale terapia combinata antimalarica utilizzata in Vietnam (Diidroartemisinina -Piperachina), al fine di ottenere maggiori informazioni per mettere a punto dei test utili a valutare una nuova terapia combinata, contenente l’artemisinina e inibitori di Syk. Sono stati testati differenti inibitori di Syk, Gleevec e Syk inibitor II, in globuli rossi infettati dal P.falciparum. Gli esperimenti in vitro ed ex vivo hanno confermato l’attività di questi inibitori di Syk nel sopprimere la crescita del parassita, agendo sulla fase di fuoriuscita e misurando un IC50 medio al di sotto della concentrazione 2 µM. Inoltre, in diverse province del Vietnam, Quang Tri, Gia Lai e Ninh Thuan, è stato effettuato uno studio della ritardata clearance del parassita (DPC). È stata osservata una elevata prevalenza della DPC, 72 ore dopo il trattamento farmacologico, utilizzando la qPCR e il microscopio ottico. Nella provincia di Gia Lai, in pazienti con la DPC, è stata osservata anche una elevata prevalenza (80%) della mutazione C580Y, nel gene K13. Secondo con l'OMS questi risultati sono indicativi di una resistenza all’artemisinina; nonostante ciò, nei mesi successivi, i pazienti con la DPC, non hanno evidenziato alcun sintomo della ricorrenza della malaria. Successivamente è stato effettuato uno studio di fattori che potrebbero influenzare l'insorgenza della DPC. Tra questi il sesso non sembrerebbe indurre alcuna interferenza. Per quanto riguarda l'età, nella provincia Quang Tri la maggioranza dei pazienti affetti da malaria con una clearance fortemente ridotta è rappresentata dai soggetti più giovani sottolineando una certa influenza del sistema immunitario; mentre nelle altre province, considerando lo scarso numero di pazienti al di sotto dei 15 anni, non è stato possibile valutare tale parametro come fattore di interferenza. L'analisi genetica di alcune mutazioni umane a carico dei globuli rossi (HB E, Hb Constant Spring e carenza di G6PD), ha rivelato nella provincia Quang Tri, una prevalenza significativa della carenza di G6PD (variante Viangchan) nel gruppo di pazienti con ritardata clearance dei parassiti, indicando una potenziale interferenza della mutazione. Al contrario, nelle altre province nel sud del Vietnam non è stata osservata alcuna significativa interferenza di tali mutazioni con la DPC. Alla luce dei promettenti risultati ottenuti con gli inibitori Syk e considerando che l'artemisinina sembrerebbe essere ancora efficace, la prospettiva futura è rappresentata da un nuovo studio clinico nel Sud del Vietnam, per testare l'efficacia della combinazione tra la Diidroartemisina e il Gleevec.

The Artemisinin-based combination therapies remain the most effective treatment for uncomplicated P.falciparum malaria; however, resistance to artemisinin has been detected in some areas of the Southeast Asia. In the light of this topic, the development of new antimalarial represents one of the main target. During the intra-erythrocyte cycle of P.falciparum the band 3 is tyrosine phosphorylated by Syk kinase, inducing membrane vesiculation with a consequent membrane weakening. Syk inhibition suppresses both band 3 phosphorylation and vesiculation, consequently the parasite egress and their capability to infect new erythrocytes. The purpose of the present work is to investigate in vitro and in vivo activity of Syk inhibitors on parasite growth, and to evaluate the efficacy of the current antimalarial therapy in Vietnam, Dihidroartemisinin-Piperaquine, in order to obtain more information and to set a panel of tests required to evaluate the usefulness of a new Artemisinin Combination Therapy, containing Syk inhibitors, as malaria treatment. Different Syk inhibitors, Gleevec and the Syk inhibitor II, have been tested in P. falciparum infected RBCs. The in vitro and ex vivo experiments confirmed the activity of these Syk inhibitors to suppress the parasite growth, markedly affecting the egress phase, with an average of IC50 below 2 µM. The presence of delayed parasite clearance, DPC, was examined in Vietnam. In the provinces of Quang Tri, Gia Lai and Ninh Thuan, it was observed a high prevalence of DPC by qPCR and by light microscopy. In addition, in the Gia Lai province was observed a high prevalence (80 %) of the mutation C580Y on K13 gene, in the patients with DPC. According with WHO these results are indicative of artemisinin resistance; however, in the following months, the patients, which presented DPC, have not shown the recurrence of malaria symptoms. Successively factors that could influence the insurgence of DPC were investigate. The sex does not seem to interfere. Regarding the age in Quang Tri, the large majority of the malaria patients with a strongly reduced clearance has been observed in younger patients, indicating an important role of the immune response; nevertheless the poor number of young patients in the other provinces ,we cannot draw any assumptions. The analysis of some human mutations affecting the RBCs (HB E, Hb Constant Spring and G6PD deficiency Viangchan) in Quang Tri, revealed a significative prevalence of G6PD deficiency Viangchan, in the group of patients with delayed parasite clearance, indicating its potential interference. Conversely, in Gia Lai and Ninh Thuan, within the different groups of malaria patients, it has been observed no significant interference of any mutations with the DPC (p-value > 0.05). In the light of the prominent results obtained using Syk inhibitors, and considering that the artemisinin appears to be still efficacy, the future plan is to perform a new clinical trial in South Vietnam, to test the efficacy of Gleevec in combination with Dihidroartemisin.