IN VITRO STUDY OF THE EFFECTS OF ENDOTELIN-1: RELEVANCE TO THE PATHOGENESIS OF PULMONARY ARTERIAL HYPERTENSION IN SYSTEMIC SCLEROSIS

Introduzione: L'ipertensione arteriosa polmonare è una patologia grave con una sopravvivenza dei pazienti stimata del 68% a 1 anno, 48% a 3 anni e il 34% a 5 anni dalla diagnosi. Il ruolo dell’endotelina-1 è stato studiato in diverse condizioni patologiche tra le quali la sclerosi sistemica; nei pazienti affetti da sclerosi sistemica, l’endotelina-1 circolante è presente ad alto titolo suggerendo il suo coinvolgimento nello sviluppo del danno fibrotico e vascolare. L’endotelina-1 è, infatti, un peptide con attività pro-fibrotica, pertanto gli inibitori dei recettori endotelinici (ETA e ETB) possono esercitare un effetto anti-fibrotico. A livello vasale, inoltre, l'equilibrio degli effetti mediati dall’endotelina-1 sulle cellule muscolari lisce e sulle cellule endoteliali è responsabile dell'omeostasi del tono vascolare. Un altro interessante effetto dell’endotelina-1 sulle cellule endoteliali è l'induzione della produzione di aldosterone che, a sua volta, sembrerebbe incrementare i livelli di specie reattive dell'ossigeno. L'aldosterone è un mediatore chiave nel danno vascolare polmonare in risposta all’ipossia: l'attivazione del recettore per mineralcorticoidi dovuto all’aldosterone nelle cellule endoteliali in vitro è coinvolta nel rimodellamento vascolare e nella fibrosi in risposta all'ipossia e l’utilizzo di antagonisti aldosteronici attenua questi fenomeni.Metodi: Per valutare l'espressione delle due isoforme recettoriali dell’endotelina-1 e del recettore per mineralcorticoidi, sono state effettuate analisi di reverse transcriptase-PCR, western blot e citofluorimetria. L'attivazione dei fibroblasti è stata valutata misurando con kit ELISA la quantità di collagene-1, TGF-β e PDGF nel terreno di coltura. La rilevazione della formazione di stress ossidativo intracellulare è stata valutata con citometria a flusso misurando la fluorescenza emessa dalla CM-H2DCFDA dopo incubazioni lunghe o brevi con endotelina-1 e i suoi inibitori recettoriali o con l’aldosterone e il suo antagonista.Risultati: Entrambi i recettori per l’endotelina-1 sono presenti sulla superficie dei fibroblasti polmonari umani e dei fibroblasti dermici normali umani disponibili incommercio, ma anche su quella dei fibroblasti dermici ottenuti da donatori sani e da pazienti sclerodermici. L’espressione del recettore per mineralcorticoidi è stata rilevata nei fibroblasti polmonari umani, nei fibroblasti dermici sclerodermici e nelle cellule endoteliali polmonari umane mentre nei fibroblasti dermici normali umani e in quelli da donatori sani, la quantità di proteina recettoriale rilevata è stata più bassa che nelle altre cellule analizzate. Nei fibroblasti polmonari umani, in quelli dermici sclerodermici e nelle cellule endoteliali polmonari umane, l’endotelina-1 ha stimolato la produzione di specie reattive dell’ossigeno dopo incubazioni lunghe; tale produzione è stata inibita dall’utilizzo del bloccante per il recettore ETB. L’aldosterone invece, ha stimolato la produzione di specie reattive dell’ossigeno dopo brevi incubazioni nei fibroblasti polmonari umani, in quelli dermici sclerodermici e nelle cellule endoteliali polmonari umane ma non nei fibroblasti dermici umani normali e in quelli dermici da donatori sani. Analoghi risultati sono stati ottenuti nei fibroblasti polmonari umani, in quelli dermici sclerodermici e nelle cellule endoteliali polmonari umane stimolandoli a lungo con endotelina-1 in presenza o assenza dell’inibitore del recettore per mineralcorticoidi.Conclusioni: Questi risultati suggeriscono che l'endotelina-1 attiva i fibroblasti e la produzione di aldosterone, il vero responsabile dello stress ossidativo. L'inibizione della produzione di specie reattive dell'ossigeno dovuta all’utilizzo dell'antagonista del recettore ETB, indica che tale recettore è implicato in questo processo. Sono state trovate differenze nella produzione di stress ossidativo dopo stimolazione con endotelina-1 tra i fibroblasti dermici ottenuti da donatori sani e quelli da pazienti sclerodermici. Inoltre, negli stessi tipi cellulari, sono state evidenziate differenze nella presenza del recettore per mineralcorticoidi.

Background: Pulmonary arterial hypertension is a devastating disease with an estimated patients’ survival of 68% at 1 year, 48% at 3 years and 34% at 5 years from diagnosis. The role of endothelin-1 has been studied in different conditions including systemic sclerosis. In systemic sclerosis patients, circulating endothelin- 1 is present at high levels, suggesting its involvement in the development of fibrotic and vascular damage. Indeed endothelin-1 is a potent pro-fibrotic peptide and inhibitors of endothelin-1 receptors (ETA and ETB) may exert an anti-fibrotic effect. The balance of endothelin-1 effects on smooth muscle cells and on endothelial cells is responsible for the homeostasis of vascular tone. Another interesting effect of endothelin-1 is the induction of aldosterone in endothelial cells that eventually results in the production of reactive oxygen species. Aldosterone is a key mediator of the pulmonary vascular injury response to hypoxia: mineralocorticoid receptor activation by aldosterone is involved in the remodeling/fibrosis response to hypoxia in endothelial cells in vitro and aldosterone antagonism attenuates these events.Methods: Reverse transcriptase-PCR, western blot and cytofluorimetric analyses were performed to evaluate the expression of the two isoforms of endothelin-1 receptors and mineralocorticoid receptor. Activation of fibroblast was evaluated measuring the amount of collagen-1, TGF-β and PDGF with ELISA kits. The detection of intracellular oxidative stress formation was measured with flow cytometry using fluorescence of CM-H2DCFDA after long or short incubations with endothelin-1 and its receptors inhibitors or with aldosterone and its antagonist.Results: Both endothelin-1 receptors are present in commercially available human pulmonary fibroblasts and normal human dermal fibroblasts, human dermal fibroblasts from healthy donors and scleroderma human dermal fibroblasts. Mineralocorticoid receptor expression was detected in human pulmonary fibroblasts, scleroderma human dermal fibroblasts and human pulmonary arteryendothelial cells while in normal human dermal fibroblasts and human dermal fibroblasts from healthy donors the amount of this receptor was lower than the other cells analyzed. In human pulmonary fibroblasts, scleroderma human dermal fibroblasts and human pulmonary artery endothelial cells, endothelin-1 stimulates the production of reactive oxygen species after a long incubation. In addition, the production of oxygen radicals is inhibited by the use of ETB antagonist. Interestingly, aldosterone stimulates the production of reactive oxygen species after a short incubation in human pulmonary fibroblasts, scleroderma human dermal fibroblasts and human pulmonary artery endothelial cells, but not in normal human dermal fibroblasts and human dermal fibroblasts from healthy donors. The same results were obtained by human pulmonary fibroblasts, scleroderma human dermal fibroblasts and human pulmonary artery endothelial cells stimulated with endothelin-1 for long time with mineralocorticoid receptor inhibitor.Conclusions: These results suggest that endothelin-1 activates fibroblasts and the production of aldosterone, the true responsible for oxidative stress. The inhibition of reactive oxygen species production using the ETB antagonist indicates that the ETB receptor is implicated in this process. Moreover we found differences between fibroblasts from healthy donors and from scleroderma patients in oxidative stress production after endothelin-1 stimulation. Finally we found differences in mineralocorticoid receptor presence in the same cell types.