La sarcopenia è una condizione di atrofia correlata all’età, che può rappresentare per le persone anziane un potenziale fattore di rischio per fragilità, perdita di indipendenza e disabilità fisica. La distrofia miotonica (DM) è una malattia genetica neuromuscolare degenerativa a carattere autosomico dominate. Sarcopenia e DM sono patologie che mostrano alcune caratteristiche comuni quali la riduzione delle fibre muscolari, nuclei disposti centralmente e organizzati in cluster, cellule satellite mal funzionanti. Inoltre, sia nella sarcopenia che nella DM si osserva nei nuclei delle miofibre e delle cellule satellite un accumulo di ribonucleoproteine associato ad un rallentamento dei processi di trascrizione/maturazione con conseguente riduzione della capacità rigenerative del tessuto muscolare. In questo lavoro di tesi sono state esplorate due diverse possibilità terapeutiche per contrastare queste due patologie: è stato studiato l’effetto di un esercizio fisico adattato (approccio non farmacologico) e sono stati testati cinque tipi di nanoparticelle (NP) - NP di chitosano, NP fosfolipidiche con manganese, liposomi, NP polimeriche a base di cianoacrilati e NP di silice mesoporosa- potenzialmente idonee per il trasporto di molecole in grado di ridurre gli aggregati nucleari di RNA (approccio farmacologico). Le osservazioni in microscopia ottica ed elettronica a trasmissione hanno dimostrato che, in topi vecchi (28 mesi), l’esercizio fisico è in grado di ristabilire, almeno parzialmente, le condizioni del muscolo scheletrico di un topo adulto (12 mesi). Tutte le NP, testate in vitro su linee cellulari umane e murine, si sono dimostrate biocompatibili. Per progettare validi protocolli di somministrazione, è stato indagato mediante microscopia ottica ed elettronica a trasmissione il meccanismo cellulare di internalizzazione, il destino intracellulare e i rapporti delle NP con i diversi organuli cellulari. Le NP di chitosano si sono rivelate efficaci carrier per la molecola testata e non sono state riscontrate alterazioni cellulari; presentano però difficoltà nell’internalizzazione, forse a causa della loro tendenza all’aggregazione, persistono molto a lungo nella cellula e riescono ad entrare nel nucleo, costituendo quindi un potenziale rischio. Le NP fosfolipidiche con manganese sono anch’esse buoni sistemi carrier e costituiscono una valida alternativa al gadolinio come mezzo di contrasto in risonanza magnetica nucleare; entrano efficacemente nella cellula, probabilmente per fusione con il plasmalemma, permangono per circa 24 ore nel citoplasma per poi essere degradate dai lisosomi. I liposomi hanno dimostrato un’ottima capacità di entrare nella cellula, probabilmente anch’essi mediante fusione con la membrana plasmatica, e vengono degradati velocemente; determinano però segni di sofferenza cellulare, probabilmente dovuti ad un eccesso di internalizzazione. Le NP polimeriche a base di cianoacrilati e le NP di silice mesoporosa vengono internalizzate mediante endocitosi e, da quanto osservato, non danneggiano le strutture citoplasmatiche. Le NP polimeriche vanno incontro a massiva degradazione entro 24 ore, mentre quelle di silice mesoporosa permangono inalterate nelle cellule, sebbene confinate all’interno di vacuoli. I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi forniscono una solida base sperimentale per futuri studi sull’utilizzo dell’esercizio fisico e delle nanotecnologie come approcci terapeutici per sarcopenia e DM.

Sarcopenia is a condition of age-related muscle atrophy representing a risk factor for frailty, loss of independence and physical disability in the elderly. Myotonic dystrophy (DM) is an autosomal dominant disorder characterized by muscle dystrophy and dysfunction. Sarcopenia and DM share common features such as reduction in muscle fiber size, centrally located and/or clumped nuclei, defective satellite cells. Moreover, in both sarcopenia and DM, ribonucleoproteins accumulate in nuclei of muscle fibers and satellite cells thereby hampering transcription/maturation processes and causing a reduction in the regenerative capacity of the muscle tissue. In this work, two strategies have been explored to counteract these two pathologies namely, adapted physical exercise (considered a non-pharmacological approach) and nanotechnology (considered a tool for a pharmacological approach); five types of nanoparticles (NPs), i.e. chitosan NPs, Mn-based phospholipidic NPs, liposomes, cyanoacrylate-based NPs and mesoporous silica NPs (MSN-NPs) were investigated as carriers for the delivery of molecules able to reduce nuclear RNA aggregates. Observations at light- and transmission electron microscopy have shown that, in old mice (28 months), adapted physical exercise is able to partially restore the conditions of the skeletal muscle typical of adulthood (12 months). All NPs, tested in vitro on human and murine cell lines, proved to be biocompatible. To pave the way for valid administration protocols, the cellular mechanisms of NP internalization, their intracellular fate and their relationships with cell organelles have been investigated by fluorescence (conventional and confocal) microscopy and transmission electron microscopy Chitosan NPs proved to be efficient carriers for the tested molecule, without inducing cell alterations; however, they showed low internalization rate, maybe because of a tendency to aggregate. They persisted for very long time inside the cell and were able to enter the nucleus, thus constituting a potential risk. Mn-based NPs acted as good drug carrier systems and constitute a valid alternative to gadolinium as contrast agent for nuclear magnetic resonance; they efficiently entered the cells, probably by fusion with the plasma membrane, and remained for about 24 hours in the cytoplasm before degradation in the lysosomes. Liposomes demonstrated an excellent ability to enter the cell, probably by fusion with the plasma membrane (similar to Mn-based NPs), then they were quickly degraded; however, the cells showed some structural alterations, probably due to an excess of uptake. Cyanoacrylate-based NPs and MSN-NPs were internalized by endocytosis and no damage of cell structures was found. Cyanoacrylate-NPs underwent massive degradation within 24 hours, whereas MSN-NPs remained unaltered in the cells, although confined within vacuoles. The results obtained in this work provide a solid experimental basis for future studies on the use of physical exercise and nanotechnology for the development of new therapeutic approaches for sarcopenia and DM.

Pilot studies for the treatment of sarcopenia and myotonic dystrophy: a multimodal approach

COSTANZO, Manuela
2016-01-01

Abstract

Sarcopenia is a condition of age-related muscle atrophy representing a risk factor for frailty, loss of independence and physical disability in the elderly. Myotonic dystrophy (DM) is an autosomal dominant disorder characterized by muscle dystrophy and dysfunction. Sarcopenia and DM share common features such as reduction in muscle fiber size, centrally located and/or clumped nuclei, defective satellite cells. Moreover, in both sarcopenia and DM, ribonucleoproteins accumulate in nuclei of muscle fibers and satellite cells thereby hampering transcription/maturation processes and causing a reduction in the regenerative capacity of the muscle tissue. In this work, two strategies have been explored to counteract these two pathologies namely, adapted physical exercise (considered a non-pharmacological approach) and nanotechnology (considered a tool for a pharmacological approach); five types of nanoparticles (NPs), i.e. chitosan NPs, Mn-based phospholipidic NPs, liposomes, cyanoacrylate-based NPs and mesoporous silica NPs (MSN-NPs) were investigated as carriers for the delivery of molecules able to reduce nuclear RNA aggregates. Observations at light- and transmission electron microscopy have shown that, in old mice (28 months), adapted physical exercise is able to partially restore the conditions of the skeletal muscle typical of adulthood (12 months). All NPs, tested in vitro on human and murine cell lines, proved to be biocompatible. To pave the way for valid administration protocols, the cellular mechanisms of NP internalization, their intracellular fate and their relationships with cell organelles have been investigated by fluorescence (conventional and confocal) microscopy and transmission electron microscopy Chitosan NPs proved to be efficient carriers for the tested molecule, without inducing cell alterations; however, they showed low internalization rate, maybe because of a tendency to aggregate. They persisted for very long time inside the cell and were able to enter the nucleus, thus constituting a potential risk. Mn-based NPs acted as good drug carrier systems and constitute a valid alternative to gadolinium as contrast agent for nuclear magnetic resonance; they efficiently entered the cells, probably by fusion with the plasma membrane, and remained for about 24 hours in the cytoplasm before degradation in the lysosomes. Liposomes demonstrated an excellent ability to enter the cell, probably by fusion with the plasma membrane (similar to Mn-based NPs), then they were quickly degraded; however, the cells showed some structural alterations, probably due to an excess of uptake. Cyanoacrylate-based NPs and MSN-NPs were internalized by endocytosis and no damage of cell structures was found. Cyanoacrylate-NPs underwent massive degradation within 24 hours, whereas MSN-NPs remained unaltered in the cells, although confined within vacuoles. The results obtained in this work provide a solid experimental basis for future studies on the use of physical exercise and nanotechnology for the development of new therapeutic approaches for sarcopenia and DM.
2016
Sarcopenia, myotonic dystrophy, physical exercise, nanoparticles
La sarcopenia è una condizione di atrofia correlata all’età, che può rappresentare per le persone anziane un potenziale fattore di rischio per fragilità, perdita di indipendenza e disabilità fisica. La distrofia miotonica (DM) è una malattia genetica neuromuscolare degenerativa a carattere autosomico dominate. Sarcopenia e DM sono patologie che mostrano alcune caratteristiche comuni quali la riduzione delle fibre muscolari, nuclei disposti centralmente e organizzati in cluster, cellule satellite mal funzionanti. Inoltre, sia nella sarcopenia che nella DM si osserva nei nuclei delle miofibre e delle cellule satellite un accumulo di ribonucleoproteine associato ad un rallentamento dei processi di trascrizione/maturazione con conseguente riduzione della capacità rigenerative del tessuto muscolare. In questo lavoro di tesi sono state esplorate due diverse possibilità terapeutiche per contrastare queste due patologie: è stato studiato l’effetto di un esercizio fisico adattato (approccio non farmacologico) e sono stati testati cinque tipi di nanoparticelle (NP) - NP di chitosano, NP fosfolipidiche con manganese, liposomi, NP polimeriche a base di cianoacrilati e NP di silice mesoporosa- potenzialmente idonee per il trasporto di molecole in grado di ridurre gli aggregati nucleari di RNA (approccio farmacologico). Le osservazioni in microscopia ottica ed elettronica a trasmissione hanno dimostrato che, in topi vecchi (28 mesi), l’esercizio fisico è in grado di ristabilire, almeno parzialmente, le condizioni del muscolo scheletrico di un topo adulto (12 mesi). Tutte le NP, testate in vitro su linee cellulari umane e murine, si sono dimostrate biocompatibili. Per progettare validi protocolli di somministrazione, è stato indagato mediante microscopia ottica ed elettronica a trasmissione il meccanismo cellulare di internalizzazione, il destino intracellulare e i rapporti delle NP con i diversi organuli cellulari. Le NP di chitosano si sono rivelate efficaci carrier per la molecola testata e non sono state riscontrate alterazioni cellulari; presentano però difficoltà nell’internalizzazione, forse a causa della loro tendenza all’aggregazione, persistono molto a lungo nella cellula e riescono ad entrare nel nucleo, costituendo quindi un potenziale rischio. Le NP fosfolipidiche con manganese sono anch’esse buoni sistemi carrier e costituiscono una valida alternativa al gadolinio come mezzo di contrasto in risonanza magnetica nucleare; entrano efficacemente nella cellula, probabilmente per fusione con il plasmalemma, permangono per circa 24 ore nel citoplasma per poi essere degradate dai lisosomi. I liposomi hanno dimostrato un’ottima capacità di entrare nella cellula, probabilmente anch’essi mediante fusione con la membrana plasmatica, e vengono degradati velocemente; determinano però segni di sofferenza cellulare, probabilmente dovuti ad un eccesso di internalizzazione. Le NP polimeriche a base di cianoacrilati e le NP di silice mesoporosa vengono internalizzate mediante endocitosi e, da quanto osservato, non danneggiano le strutture citoplasmatiche. Le NP polimeriche vanno incontro a massiva degradazione entro 24 ore, mentre quelle di silice mesoporosa permangono inalterate nelle cellule, sebbene confinate all’interno di vacuoli. I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi forniscono una solida base sperimentale per futuri studi sull’utilizzo dell’esercizio fisico e delle nanotecnologie come approcci terapeutici per sarcopenia e DM.
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