Pathogenesis of iron overload in congenital dyserythropoietic anemia type II (CDAII)

L’omeostasi del ferro svolge un ruolo cruciale nella normale eritropoiesi e in anemie da sovraccarico di ferro, come ad esempio la β-talassemia intermedia e le anemie congenite diseritropoietiche (CDAs), che rappresentano interessanti modelli umani per studiare l'eritropoiesi patologica. Le CDAs sono malattie genetiche che provocano la distruzione midollare delle cellule eritroidi, ossia l’eritropoiesi inefficace. Ciò causa un’iperplasia eritroide nel midollo e l’anemia con una risposta sub-ottimale dei reticolociti. Quattro le forme di CDAs ben note, il tipo II è la forma più frequente, il cui gene causativo, SEC23B, è coinvolto nel traffico vescicolare tra reticolo endoplasmatico e il Golgi. La cirrosi, il diabete e i calcoli biliari sono le complicazioni più comuni causate dall’anomalo accumulo di ferro. I meccanismi responsabili di tali complicazioni, dovute principalmente al sovraccarico di ferro, restano da chiarire. Lo scopo di questo studio sta proprio nel chiarire il ruolo del gene SEC23B nel sovraccarico di ferro attraverso studi in vivo e in vitro. Negli studi in vivo abbiamo valutato i livelli dei marcatori del sovraccarico di ferro, quali il fattore di crescita differenziale 15 (GDF15), il recettore solubile della transferrina (sTfR), l’emojuvelina solubile (sHJV), la ferritina e l’epcidina nel siero o plasma dei pazienti CDAII. I livelli sierici o plasmatici di queste molecole sono stati correlati con i parametri biochimici del ferro ed i parametri ematologici per identificare i marcatori prognostici in grado di predire l'insorgenza del sovraccarico di ferro. Quindi, questi dosaggi, se fatti durante l'infanzia o l'adolescenza, possono essere analizzati come marker di gravità della malattia per lo sviluppo di strategie di trattamento preventive per i bambini CDAII o altri affetti da eritropoiesi inefficace. Con gli studi in vitro, invece, abbiamo effettuato una caratterizzazione del sovraccarico di ferro nella linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano (Huh7) e nella linea cellulare umana di leucemia eritromieloblastoide (K562) silenziate per il gene SEC23B per analizzare l'espressione genica dei geni del metabolismo del ferro. Inoltre abbiamo caratterizzato il nuovo regolatore eritroide, Eritroferrone (Erfe), sia in vivo nei pazienti CDAII, che in vitro nelle linee cellulari silenziate per l'espressione genica di SEC23B. I livelli sTfR indicano il numero di precursori dei globuli rossi e la richiesta di ferro da parte delle cellule. Nel nostro studio, sTfR è aumentato nei pazienti e correla negativamente con l’epcidina e la ferritina sierica, nonostante il suo ruolo di inibitore della sintesi di epcidina. Quindi, sTfR non influenza la sintesi di epcidina nella CDAII e per questo non può esserne un importante regolatore negativo nella patologia in esame. Anche sHJV è un inibitore dell’epcidina, quindi per la prima volta i suoi livelli sono stati analizzati nella CDAII. Noi abbiamo osservato che i pazienti rispetto ai controlli sani hanno livelli di sHJV più alti e che questa molecola correla con la gravità del fenotipo ematologico e con il sovraccarico di ferro nella CDAII. L'eritropoietina media l'eritropoiesi e aiuta la maturazione e lo sviluppo degli eritroblasti nelle fasi di sviluppo successive. I livelli di EPO nei pazienti CDAII sono più alti rispetto ai controlli sani. Questi dati confermano che l'anemia nella CDAII potrebbe essere dovuta a un deficit della funzione ematopoietica del midollo osseo, poiché il livello di EPO è aumentato nel paziente anemico che ha un numero insufficiente di nuovi globuli rossi. I nostri dati dimostrano, inoltre, che il GDF15 è coinvolto nell’accumulo di ferro nei pazienti CDAII. Le sue concentrazioni correlano con la gravità dell'anemia e la disponibilità di ferro sierico nei pazienti, rispecchiando la gravità dell’eritropoiesi inefficace. Il GDF15 modula l'espressione dell’epcidina in risposta al sovraccarico di ferro e aumenta l'assorbimento di ferro in condizioni di stress eritropoietico. Quindi, per predire la gravità della malattia nei pazienti CDAII è possibile combinare le informazioni sulle concentrazioni del GDF15 con gli altri marcatori del sovraccarico di ferro.

Iron homeostasis plays a crucial role in normal erythropoiesis as well as in iron loading anemias, such as β-thalassemia intermedia and CDAs (congenital dyserythropoietic anemias), which represent interesting human models to study abnormal erythropoiesis. CDAs are genetic disorders which result in intramedullary destruction of developing erythroid cells (ineffective erythropoiesis). The disorder of erythropoiesis results in the paradoxical association of a bone marrow showing marked erythroid hyperplasia and anemia with a suboptimal reticulocyte response. Three forms of CDAs are well known: the type II is the most frequent, whose causative gene, SEC23B, is involved in ER-Golgi network. Cirrhosis and hemochromatosis, diabetes and gallstones are common complications due to abnormal iron accumulation. The mechanisms responsible for such complications mainly due to iron overload remain to be elucidated. In this work we investigated the role of SEC23B gene in iron overload through studies in vivo e in vitro. In in vivo studies we evaluated growth differentiation factor 15 (GDF15), soluble transferrin receptor (sTfR), soluble hemojuvenil (sHJV), ferritin and hepcidin levels in serum or plasma samples of CDAII patients as iron overload markers. Serum or plasma levels of these molecules were correlated with iron biochemical and hematological parameters to identify prognostic markers to predict the onset of iron overload in CDAII. So these measurements in infancy or childhood may be explored as a disease severity marker for development of preventative treatment strategies for CDAII children or others with ineffective erythropoiesis. In in vitro studies we performed a characterization of CDAII iron overload in human hepatocarcinoma (Huh7) cell line and in human erythromyeloblastoid leukemia (K562) cell line silenced for SEC23B to analyse gene expression of iron metabolism genes. We also characterized the new erythroid regulator erythroferrone (Erfe) both in vivo in CDAII patients and also in vitro in cell lines silenced for SEC23B gene expression. The levels sTfR are indicative of the number of red blood cell precursors and their demand for iron. In our study, sTfR was increased in CDAII patients and negatively correlated with hepcidin and serum ferritin, despite the predicted role of sTfR as an inhibitor of hepcidin. Together with previous findings, sTfR failed to affect hepcidin concentrations, suggesting that sTfR may not be a major suppressor of hepcidin in CDAII patients. In order to investigate whether sHJV down-regulates hepcidin contributing to iron loading pathology, for the first time its levels was analysed in CDAII. We reported high levels of sHJV in CDAII patients compared to healthy controls and its correlation with the severity of hematological phenotype and also iron overload in CDAII. Erythropoietin (EPO) is the main signalling molecules which mediates erythropoiesis and helps the maturation and development of erythroblasts in the later developmental stages. EPO levels in CDAII patients are increased. This data confirms that anemia in CDAII could be due to a deficiency of hematopoietic function of bone marrow, because the level of EPO is increased in anemic patient who has an insufficient number of new red blood cells. Our results reveals that EPO is involved in iron overload decreasing hepcidin expression. Also GDF15 is involved in the iron accumulation in CDAII patients. Its concentrations correlate with the severity of anaemia and serum iron availability in patients, so it reflects the magnitude of the ineffective erythropoiesis. Our data support a role for GDF15 in blunting hepcidin expression in response to iron overload and increasing iron absorption under erythropoietic stress conditions. So, it may be possible to combine information about GDF15 concentrations with other indicators to predict disease severity in CDAII patients.