ROLE OF NOTCH SIGNALING IN STROMA-DEPENDENT ACUTE MYELOID LEUKEMIA CELL CHEMORESISTANCE.

Studi preclinici e clinici hanno dimostrato il ruolo di Notch nello sviluppo di vari tipi di cancro e nella loro risposta alla chemioterapia. Di recente, il nostro gruppo di ricerca ha mostrato che l’inibizione di Notch sopprime la chemioresistenza mediata dallo stroma nei confronti delle neoplasie linfoidi.Tuttavia, il ruolo di Notch nelle leucemie acute mieloidi (AML), e il suo contributo nell’interazione tra cellule leucemiche e cellule stromali midollari rimane ancora controverso.In questo studio, abbiamo valutato il ruolo mediato dall’attivazione di Notch nella proliferazione, sopravvivenza e chemioresistenza di cellule di AML in co-coltura con cellule stromali mesenchinali isolate da midollo osseo di donatori sani (hBM-MSC) e pazienti con AML (hBM-MSC*). L’espressione del recettore Notch e dei suoi ligandi era simile tra hBM-MSC e hBM-MSC*, ad eccezione di Notch1 e Jagged1 che invece erano maggiormente espressi nelle hBM-MSC*. Inoltre, almeno il 50% dei pazienti di AML mostravano una basale attivazione della via del Notch, e la sua attivazione ed espressione era modulata dopo co-coltura con hBM-MSC*. In particolare, hBM-MSC* supportavano maggiormente la proliferazione delle cellule di AML e inducevano chemioresistenza rispetto alle hBM-MSC. In presenza di chemioterapici, sia il trattamento con inibitori che quello con anticorpi bloccanti del Notch, riduceva significativamente l’effetto supportivo mediato dalle hBM-MSC e hBM-MSC* nei confronti dei blasti leucemici di AML. L’inibizione specifica di Notch1, 2, 3 o di Jagged1, 2 riduceva parzialmente la chemioresistenza delle cellule di AML in co-coltura con le hBM-MSC. Al contrario, si aveva un recupero totale della chemiosesitività quando alle co-colture era aggiunto l’inibitore di Notch4.In un secondo momento, per studiare più a fondo i meccanismi alla base dell’attivazione del Notch, mediante l’uso di plasmidi shRNA, abbiamo effettuato un silenziamento di RBP-jK, il principale fattore di trascrizione della via del Notch. Il silenziamento eseguito su due linee di AML, ovvero HL-60 e THP1, induceva una maggiore sensibilità al trattamento con i farmaci rispetto alle cellule controllo infettate con un shRNA non specifico. Inoltre, il knock-down di RBP-jk correlava con i bassi livelli di proteine coinvolte nella sopravvivenza cellulare, come AKT, STAT3 and NF-κB. Analogamente, il blocco farmacologico del Notch attraverso gli inibitori della gamma-secretasi, sommato all’effetto sinergico mediato dalla chemioterapia, attivava l’asse Bax/caspasi-3 riducendo l’espressione di AKT, STAT3 and NF-κB in cellule di AML co-coltivate con hBM-MSC.Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che l’inibizione del Notch potrebbe rappresentare un potenziale target terapeutico non soltanto per le neoplasie linfoidi ma anche per le AML, bypassando la chemioresistenza indotta dallo stroma.

Both preclinical and clinical investigations suggest that Notch signaling is critical for the development of many cancers and for their response to chemotherapy. We previously showed that Notch inhibition abrogates stromal-induced chemoresistance in lymphoid neoplasms.However, the role of Notch in acute myeloid leukemia (AML) and its contribution to the crosstalk between leukemia cells and bone marrow stromal cells remain controversial.In this study, we evaluated the role of the Notch pathway in the proliferation, survival and chemoresistance of AML cells in co-culture with bone marrow mesenchymal stromal cells expanded from both healthy donors (hBM-MSCs) and AML patients (hBM-MSCs*). hBMMSCs and hBM-MSCs* showed similar expression of Notch receptors and ligands, except for Notch1 and Jagged1 that were expressed at higher level by hBM-MSCs*. In addition, at least 50% of AML samples showed basal Notch activation, and the expression and activation pattern was modulated after co-culture with hBM-MSCs*. Notably, hBM-MSCs* were more efficient in supporting AML proliferation and inducing AML chemoresistance, as comparedto hBM-MSCs. Treatment with either Notch inhibitors or combinations of Notch receptorblocking antibodies significantly lowered the supportive role of hBM-MSCs and hBMMSCs* towards AML blast cells in presence of chemotherapeutic agents. The specific blockade of Notch1, 2, 3 or Jagged1, 2 reduced partially the chemoresistance, while Notch4 blockade restored completely primary AML cell chemosensitivity when in co-culture withhBM-MSCs. With the aim to unravel the mechanisms underlying Notch activation, we silenced the main Notch transcription factor RBP-jK through shRNA plasmids in two AML cells lines, namely HL-60 and THP1. Consistently, silenced cells were more sensible to drug treatment than cells infected with non-specific shRNA. Interestingly, RBP-jk knock-down was associated with low levels of pro-survival proteins, such as AKT, STAT3 and NF-κB.Accordingly, we found that Notch pharmacological blockade through gamma-secretase inhibitors in synergy with chemotherapy activates Bax/caspase-3 axis by lowering the protein level of AKT, STAT3 and NF-κB in AML cells in co-culture with hBM-MSCs.Our results suggest that Notch signaling inhibition, by overcoming the stromal-mediated promotion of chemoresistance, may represent a potential therapeutic target not only for lymphoid neoplasms but also for AML.