ASSOCIATION BETWEEN CANDIDATE GENE POLYMORPHISMS AND ASTHMA SEVERITY IN ADULTS. A BAYESIAN ANALYSIS.

Introduzione Diversi geni sono associati con misure di gravità dell'asma, definite secondo classificazioni categoriali. Tuttavia, è preferibile utilizzare misure continue di gravità della malattia in quanto permettono di catturare l'eterogeneità dei fenotipi e permettono di aumentare la potenza in studi di associazione. Inoltre, a causa della complessità dei processi patologici legati all'asma, è preferibile utilizzare modelli statistici che testano contemporaneamente l'effetto di tutte le varianti genetiche e che hanno una maggiore potenza nell'identificare fenotipi associati alle varianti genetiche, rispetto ai modelli che considerano una sola variante alla volta.ObiettiviLa tesi si pone i seguenti obiettivi: (i) identificare misure continue di gravità dell'asma (Studio 1) e (ii) valutare l'associazione tra tali misure e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni candidati (Studio 2) in soggetti asmatici adulti della popolazione generale.Al fine del raggiungimento di tali obiettivi sono stati utilizzati i dati raccolti nello studio “Gene Environment Interactions in Respiratory Diseases” (GEIRD, 2007-2010), basato su un disegno multi-caso/controllo innestato in una coorte dove i casi e i controlli sono stati identificati attraverso un processo di screening in due fasi (questionario + stadio clinico) all’interno di coorti preesistenti e di nuovi campioni probabilistici della popolazione generale italiana.Studio 1Al fine di identificare misure continue di gravità dell’asma, sono state considerate le informazioni riguardanti i sintomi respiratori, il trattamento con farmaci antiasmatici e la funzionalità polmonare di 520 casi di asma (età 20-64) identificati in sette centri italiani (Ancona, Pavia, Salerno, Sassari, Terni, Torino e Verona). Per identificare le variabili che rappresentano la stessa dimensione della gravità dell'asma, è stata utilizzata un’analisi fattoriale esplorativa (EFA) e l'informazione contenuta in tali variabili è stata poi sintetizzata mediante un’analisi fattoriale multipla (MFA).Le variabili riguardanti i sintomi respiratori e il trattamento con farmaci antiasmatici sono state sintetizzate in una misura di gravità (STS) che varia su una scala continua con range 0-10: il valore 0 indica assenza di sintomi e di trattamento con farmaci antiasmatici; il valore 10 indica la presenza di sintomi con la massima frequenza e la massima intensità del trattamento. I risultati mostrano che STS correla positivamente con la classificazione della gravità dell'asma indicata dalle linee guida internazionali Global Initiative for Asthma (GINA), calcolata nei 137 casi di asma che riportano la diagnosi di un medico (coefficiente di Spearman = 0.91, p-value <0,0001) (validità concorrente). Inoltre, utilizzando una coorte di 1.097 asmatici europei (studio ECRHS II; 1999/2002), l’aumento dei livelli di STS al baseline (1991/1993) risulta associato positivamente con outcome di lungo periodo, quali ospedalizzazioni per problemi respiratori, giornate lavorative perse per problemi respiratori, frequenza degli attacchi di asma e uso di farmaci “controller” per la terapia dell'asma (validità predittiva). Infine, i punteggi dello score STS calcolati sui soggetti dello studio GEIRD e sui soggetti dello studio ECRHS II risultano equiparabili (coefficiente di Pearson = 0,97, p-value <0,00001) (analisi di replicazione).Studio 2Attualmente, nello studio GEIRD, i dati genetici sono stati raccolti nel solo centro di Verona. Pertanto, in questa analisi, sono stati pertanto valutati 326 soggetti asmatici (età 20-64). Un gruppo di 236 tag-SNP, rappresentativi di 53 geni candidati e selezionati poiché probabilmente associati con l'asma o COPD o rinite, è stato genotipizzato utilizzando un GoldenGate Genotyping Assay. Tali SNP soddisfano il controllo di qualità genetico. Le misure di gravità dell'asma considerate sono: lo score della frequenza dei sintomi e dell’intensità del trattamento con farmaci anti-asmatici (STS), sviluppato nella prima parte della tesi, e il FEV1% predetto pre-broncodilatatore. L'associazione tra le SNP e le due misure di gravità (STS e FEV1% predetto) è stata valutata mediante un approccio Bayesiano con i modelli di regressione zero-inflated Poisson e lineare, stimati con il metodo dei minimi quadrati LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator). Questi modelli permettono di considerare contemporaneamente tutte le varianti genetiche e permettono di ottenere una stima della loro associazione con gli outcome aggiustata per i probabili confondenti (sesso, indice di massa corporea e abitudine al fumo).L'unica SNP associata con il FEV1% predetto è rs2427829 l, che è localizzata nel gene FCER1A (media = -0,323, intervallo di credibilità = [-4,533, -0,268]). Nessuna SNP è risultata associate con il rischio di avere asma sintomatica (STS> 0 vs STS = 0). Quattro SNP sono risultate associate ad un aumento dello score STS nell’asma sintomatica (E[STS], se STS> 0), ovvero: rs573122 nel gene FCER1A (media = 0,166, intervallo di credibilità = [0,020, 0,320]), rs676750 nel gene CHML (media = -0,248, intervallo di credibilità = [-0,434, -0,072]), rs4334089 nel gene VDR (media = -0,255, intervallo di credibilità = [-0,456, -0,059]) e rs11080344 nel gene NOS2 (media = -0,224, intervallo di credibilità = [-0,390, -0,064]).ConclusioniLo score STS è una misura di gravità dell'asma negli adulti che risulta essere valida e replicabile, e che potrebbe essere utilizzata in studi epidemiologici. Tale misura è stata applicata in una analisi di associazione genetica, la quale ha evidenziato che cinque SNP (localizzate nei geni FCER1A, CHML, VDR e NOS2) potrebbero avere un ruolo nella gravità della malattia nei soggetti asmatici adulti.

Introduction Different genes are associated with categorical classifications of asthma severity. However, continuous measures of disease severity should be used to catch the heterogeneity of asthma phenotypes and to increase the power in association studies. Furthermore, due to the complex pathological processes involved in asthma, statistical models that simultaneously test the effect of all variants have a better performance and they gain power in identifying phenotypes associated to genetic variants, as compared to statistical models that consider a single variant at a time. AimsThis thesis is aimed at (i) providing continuous measures of asthma severity (Study-line 1) and (ii) evaluating the association between disease severity and single nucleotide polymorphisms (SNPs) in candidate gene regions (Study-line 2), in adult patients with ever asthma from the general population.Data from the Gene Environment Interactions in Respiratory Diseases study (GEIRD, 2007-2010), which is an Italian, population-based, (multi)case-control study on respiratory health, were used.Study-line 1Respiratory symptoms, anti-asthmatic treatment and lung function were measured on 520 cases of asthma (aged 20-64) in seven Italian centres (Ancona, Pavia, Salerno, Sassari, Terni, Torino and Verona). The variables that represent the same dimension of asthma severity were identified through an exploratory factor analysis (EFA) and were summarized through a multiple factor analysis (MFA). Only respiratory symptoms and anti-asthmatic treatment were summarized in a continuous score (STS). STS ranges from 0 (no symptoms/treatment) to 10 (maximum symptom frequency and treatment intensity). STS was positively correlated with the Global INitiative for Asthma (GINA) classification of asthma severity computed on the 137 cases with a doctor's diagnosis (Spearman’s coefficient=0.91, p-value<0.0001) (concurrent validity). Furthermore, using a cohort of 1,097 European asthmatics (ECRHS II study; 1999/2002), increasing SST levels at baseline (1991/1993) were positively associated with long-term outcomes (hospitalization and lost workdays for breathing problems, asthma attack frequency and use of asthma controllers) (predictive validity). Finally, the STS scores computed from the GEIRD and ECRHS II data were comparable (Pearson’s coefficient=0.97, p-value<0.00001) (replication analysis). Study-line 2At present, in the GEIRD study, genetic data have been collected in the Verona centre only. Therefore, only 326 subjects (aged 20-64) with ever asthma were evaluated in this analysis. A panel of 236 tag-SNPs, which are representative of 53 candidate gene regions with a previous indication of a possible association with asthma/COPD/rhinitis, was genotyped by using a custom GoldenGate Genotyping Assay and fulfilled the quality check. Measures of asthma severity are: the Symptom frequency and anti-asthmatic Treatment intensity Score (STS), which was developed in the study-line 1, and pre-bronchodilator FEV1% predicted. The association of SNPs with STS and FEV1% predicted was evaluated by using Bayesian Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) zero-inflated Poisson and linear regression models, respectively. These models allow the simultaneous selection of genetic variants and the estimation of their association with outcomes, adjusting for the effect of gender, body mass index and smoking habits. SNP rs2427829 in FCER1A was the only SNP associated with FEV1% predicted (mean = -0.323, credible interval = [-4.533, -0.268]). There were no SNPs associated with the risk of having symptomatic asthma (i.e. STS>0 vs STS=0), whereas four SNPs were associated with an increased STS in symptomatic asthma (i.e. E[STS] if STS>0): rs573122 in FCER1A (mean = 0.166, credible interval = [0.020, 0.320]), rs676750 in CHML (mean = -0.248, credible interval = [-0.434, -0.072]), rs4334089 in VDR (mean = -0.255, credible interval = [-0.456, -0.059]) and rs11080344 in NOS2 (mean = -0.224, credible interval = [-0.390, -0.064]).ConclusionsSTS is a valid and replicable measure of asthma severity in adults, which could be used in epidemiological studies. An application of this score in a genetic association analysis shows that five SNPs (in FCER1A, CHML, VDR and NOS2) could play a role in disease severity among adults with ever asthma.