Cross-talk between myeloid and mesenchymal stem cells (MSC) in the aged human bone marrow

Durante l'invecchiamento il midollo osseo subisce un rimodellamento strutturale e funzionale. La struttura ossea trabecolare contenente cellule ematopoietiche è gradualmente sostituita da una rete trabecolare rarefatta, spesso demineralizzata, ricca di adipociti a vari stadi di differenziazione, da pre-adipociti fino a corpi maturi coalescenti. Nelle ossa lunghe come il femore la riduzione della resistenza meccanica dell'osso aumenta il rischio di necrosi ossea e frattura femorale. Tale rimodellamento influisce notevolmente nell'interazione funzionale tra le cellule ematopoietiche staminali (HSC), cellule Mesenchimali Staminali (MSC), proteine della Matrice Extracellulare e la varietà di fattori solubili che compongono il microambiente midollare. Di conseguenza, le MSC si orientano verso il differenziamento adipocitario, le cellule HSC riducono la loro capacità autorigenerante, e nel frattempo si incrementa il differenziamento mieloide e si riduce la generazione di progenitori linfoidi comuni. In questo studio abbiamo esaminato alcuni aspetti dell’ interazione (cross-talk) tra Cellule Soppressorie di Derivazione Mielode (MDSC ) ed MSC in campioni di midollo osseo (BM) ottenuti da 57 soggetti compresi in un range di età tra i 18 e i 92 anni . I risultati dell'analisi emocromocitometrica e dell'immunofenotipizzazione multiparametrica hanno evidenziato che con l’aumentare dell’età si osserva una significativa riduzione del numero dei globuli bianchi (WBC) e delle cellule B che risultano ridotte negli anziani, senza un sostanziale squilibrio delle popolazioni e sottopopolazioni Mieloidi e Linfoidi; inoltre la percentuale delle MDSC rimane invariata con l’invecchiamento. Tuttavia, le MDSC degli anziani mostrano attività basale immunosoppressiva sulla proliferazione sia di linfociti T autologhi che eterologhi. Dal momento che la soppressione indotta dal trattamento con G/GM-CSF non mette in luce nessuna differenza tra i giovani e gli anziani, abbiamo ipotizzato che la soppressione basale osservata negli anziani potesse dipendere dall’accumulo progressivo di stimoli attivatori nel midollo osseo. Questi stimoli potrebbero consistere nel contatto cellulare con le MSC o adipociti o dall’attività di IL-6, IL-1β o del TNF-α , citochine molto elevate nel BM dell’anziano. Abbiamo quindi derivato colture di MSC da BM dei giovani, degli adulti e degli anziani appartenenti alla nostra casistica e, una volta caratterizzate, le abbiamo utilizzate in esperimenti di co-coltura con le MDSC dei giovani. I risultati hanno mostrato che il contatto tra MDSC e MSC , o adipociti differenziati da MSC, induceva l’attività soppressoria delle MDSC, ma non l'attività del plasma di BM degli anziani o dei surnatanti di co-colture MSC/MDSC. Abbiamo successivamente esaminato se il cross-talk tra le MSC/MDSC potesse indurre l'attivazione dell'adipogenesi delle BM-MSC. I risultati ottenuti dall’analisi delle co-colture di MSC derivate dai giovani e MDSC derivate dai soggetti anziani o viceversa hanno dimostrato che nelle MSC veniva attivato il programma adipogenico, misurato in termini di attivazione di p38 MAPK , di espressione del fattore trascrizionale C/EBPβ e dalla presenza delle gocce lipidiche nelle MSC trattate. In questo caso, anche il plasma di BM di soggetti anziani, caratterizzato dalla presenza di livelli elevati di IL-6 (500-1000 ng/ml) induceva adipogenesi, diveramente da quello dei soggetti giovani in cui L’IL-6 risultava inferiore a 2 ng/ml. E’ da notare che l'adipogenesi delle cellule MSC si associa all’induzione dell'espressione del gene di IL-6 fatto che sottolinea il ruolo autocrino e paracrino della citochina. L'attività dell'IL-6 tra le interleuchine è stata ulteriormente confermata da esperimenti dose-risposta ,attraverso l'induzione dell'adipogenesi nelle cellule MSC eseguita con IL-6 ricombinante. Questi risultati hanno dimostrato che, nel complesso, l’interazione MDSC/MSC può stabilire un circolo vizioso nel BM dei soggetti anziani, avendo come risultato l'induzione della soppressione delle cellule MDSC e dell'adipogenesi delle cellule MSC, probabilmente indotta o mantenuta da entrambi i contatti cellula-cellula e dall’ IL-6. Questi risultati aprono nuove possibilità nel determinare Markers e Target per delle strategie preventive o terapeutiche per l’invecchiamento, l'infiammazione e il riassorbimento osseo negli anziani.

Bone Marrow undergoes structural and functional reshaping during aging. The bone trabecular structure filled with hematopoietic cells is gradually replaced by a rarefied trabecular net, often demineralized, filled with adipocytes at various stages of differentiation, from pre-adipocytes to mature coalescent bodies. In long bones such as femur, this diminishes the bone mechanical strength increasing the risk of bone necrosis and femur fracture. Moreover, it deeply affects the functional interplay between Hematopoietic Stem Cells (HSC), MSCs, ECM proteins and the variety of soluble interactors composing the BM microenvironment. As a results, the MSC skew their differentiation potential toward adipocytes and Hematopoietic Stem cells reduce their self-renewing meanwhile increasing the myeloid differentiation and decreasing the generation of Common Lymphoid Progenitors. In this study we have investigated some aspects of the cross-talk between Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and Mesenchimal Stem Cells (MSC) in Bone Marrow (BM) samples obtained from 57 subject ranging 18- 92 years. Results of hemocytometric analysis and multiparametric immuno-phenotyping demonstrated that: the number of WBC decrease significantly with age, with no substantial imbalance of the myeloid and lymphoid popula-tions and subpopulations with exception of B cells, greatly reduced in elders. Also the percentage of MDSC was stable during aging. However, MDSC from elders showed a strong basal immune-suppression of autologous or het-erologous T cell proliferation. As no differences between youngster and elders were observed when suppression was induced by G/GM treatment, we hypothesized that the basal suppression observed in elders depended on the progressive accumulation in BM of activating stimuli. These could include cell-cell contact with MSC and adipocytes or the activity of IL-6, IL-1β and TNF-α that were found dramatically increased in aged BM. We therefore de-rived MSC from youngsters, adults and elders BM, characterized and used them in co-culture experiments with youngsters MDSC. Results indicated that the contact between MDSC and MSC or adipocytes, but not the activity of plasma from elders or of supernatants of MSC/MDSC co-cultures, induced the suppression activity of MDSC. We next investigated whether the cross-talk between MSC and MDSC in-duced the activation of adipogenesis in BM-MSC. Results of co-culturing youngsters MSC with elders MDSC and viceversa demonstrated that this was the case, as assessed by detecting the activation of p38 MAPK, the expression of C/EBP beta transcription factor and the presence of the lipid drops in treat-ed MSC. In contrast with what observed when inducing the suppressive activ-ity in MDSC, the BM-plasma of elders containing high levels of IL-6 (500-1000 ng/ml), but not that of youngsters almost devoid of IL-6, could efficiently replace MDSC as inducers of adipogenesis. This was of particular interest in the light of the finding that MSC adipogenesis was associated with strong induction of IL-6 gene expression. The activity of IL-6 among the other cytokines was further confirmed by dose response experiments of induction of adipogenesis in MSC performed with recombinant IL-6. Collectively these results demonstrated that a detrimental cross-talk occurs in elders BM resulting in induction of suppression in MDSC and of adipogenesis in MSC most likely induced or maintained by both cell-cells contacts and Il-6. These result open up new possibilities to define markers and targets for preventive or therapeutic strategies in aging eventually regulating immunity, inflammation and bone resorption in elders.