Non-Photochemical Quenching (NPQ) and biomass production in microalgae

La fotosintesi è il principale sistema di conversione dell’energia luminosa sul nostro pianeta. In tutti gli organismi fotosintetici come piante, alghe e cianobatteri, la fotosintesi si svolge nelle membrane tilacoidi dei cloroplasti, e permette di convertire l'energia solare in energia chimica, utilizzata per trasformare l'anidride carbonica in biomassa, producendo ossigeno come sottoprodotto. L'energia luminosa può essere anche dannosa, se in eccesso può determinare le sovraeccitazione dei fotosistemi, e la conseguente produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), molecole tossiche che danneggiano seriamente la cellula. Per evitare questa situazione critica, gli organismi fotosintetici regolano l’apparato fotosintetico, attivando diversi meccanismi fotoprotettivi. A livello della membrana tilacoidale, vi sono complessi proteici chiamati fotosistemi, con un sistema antenna (Light Harvesting Complex – LHCs), in grado di raccogliere e trasformare l’energia luminosa. Le proteine LHCs hanno un duplice fondamentale ruolo: la raccolta della luce e la regolazione dell'energia di eccitazione, per evitare la sovrasaturazione dei fotosistemi. La strategia fotoprotettiva più rapida e importante è la dissipazione termica dell’energia luminosa assorbita in eccesso, meccanismo chiamato Non-Photochemical-Quenching (NPQ), attivato da un gradiente protonico (DpH) fra le membrane tilacoidi. Nelle piante superiori, il processo di NPQ dipende dalla proteina PSBS. Nelle microalghe invece, come per la specie modello Chlamydomonas reinhardtii, è indispensabile la proteina LhcSR: proteina che lega pigmenti come clorofilla e xantofille, sensibile a pH acidi, quencher degli stati eccitati delle clorofille, con un rapido decadimento di fluorescenza. Nelle microalghe, il meccanismo di NPQ è davvero influente: fino al 80% di energia luminosa assorbita può essere dissipata sotto forma di calore, con la conseguente perdita di produttività in biomassa a favore della fotoprotezione. Lo studio del meccanismo di NPQ, permette di individuare una strategia promettente per la domesticazione delle microalghe, migliorandone la produttività. La domesticazione è indispensabile a fini commerciali: per la produzione di biomassa algale per l’alimentazione umana/animale, per l’estrazione di sostanze chimiche e farmaceutiche per la produzione di biocarburanti. Per questi motivi, il punto centrale della tesi è lo studio del meccanismo di NPQ nelle microalghe. Nella prima parte, il meccanismo NPQ è stato dettagliatamente studiato in sei diverse specie, alcune planctoniche, altre in aggregazione in biofilm. Sono state considerate misure di fluorescenza, variazione nel profilo di pigmenti e formazione di DpH transmembrana; ed è stato dimostrato l'eterogeneità del meccanismo di NPQ nelle alghe verdi: il comportamento di NPQ non è collegato alla posizione filogenetica, ma piuttosto alla pressione selettiva dell’ambientale in cui esse vivono. Alcune specie presentano un meccanismo NPQ-zeaxantina-dipendente, come per le piante superiori, mentre la correlazione è assente in altre specie algali dello stesso gruppo filogenetico. In un sistema biologico si potrebbe notevolmente aumentare produttività e biomassa, riducendo il livello di dissipazione termica dell’energia luminosa (NPQ). Per dimostrare questa ipotesi teorica, è stato studiata la correlazione tra produzione di biomassa, NPQ e accumulo di LhcSR, proteina cruciale nell’attivazione di questo fenomeno nella specie modello Chlamydomonas reinhardtii. Ceppi wild type e mutanti knock-out con ridotta induzione di NPQ, sono stati coltivati simultaneamente in un sistema di fotobioreattori, a diverse condizioni di intensità luminose. Il ceppo mutante senza le subunità proteiche di LhcSR3, presenta un ridotto livello di NPQ, e una migliore capacità di convertire fotoni in biomassa rispetto al WT. Pertanto questa è la dimostrazione che la produttività algale può essere aumentata diminuendo il livello di NPQ. Un secondo ceppo mutante senza alcun gene LhcSR (LhcSR3 e LhcSR1), con meccanismo di NPQ completamente abolito, mostra una produttività molto inferiore rispetto a WT: un livello fotoprotettivo minimo è quindi necessario. Chalmydomonas reinhardtii in condizioni di elevato irraggiamento converte l’energia luminosa a bassa efficienza, dissipando l’eccesso termicamente. In questa situazione il livello fotoprotettivo nel cloroplasto è elevato con un basso rischio di fotoinibizione, a scapito però della produzione di biomassa. In Chlamydomonas reinhardtii la proteina chiave indispensabile per l’attivazione del meccanismo di NPQ è LhcSR. In aggiunta ci sono altre proteine coinvolte, appartenenti alla famiglia LHCBM, deputate alla raccolta della luce e prevalentemente legate al fotosistema II (PSII). I geni LHCBM sono nove, altamente conservati, e nonostante l’elevata omologia, la funzione non è ridondante: alcune proteine LHCBM esercitano un ruolo ben specifico e definito. Ad esempio, LHCBM1ha un ruolo nel meccanismo di NPQ, probabilmente come partner dell'elemento regolatore principale LhcSR3, mentre LHCBM2 / 7 è coinvolta nell’induzione delle transizioni di stato. La funzione delle subunità LHCBM4, LHCBM6 e LHCBM8 è ancora sconosciuta, per questo motivo, in questo lavoro le caratteristiche biochimiche e spettroscopiche di LHCBM4, LHCBM6 e LHCBM8 sono state analizzate utilizzando proteine ricombinanti in vitro, la funzione fisiologica è stata poi studiata in-vivo utilizzando ceppi amiRNA. I risultati dimostrano il silenziamento delle subunità LHCBM4, LHCBM6 e LHCBM8, suggerendo il loro coinvolgimento nei meccanismi di fotoprotezione. Come illustrato in precedenza, la modulazione dei fenomeni NPQ, è un fattore chiave per la domesticazione delle microalghe. Le informazioni note per l'organismo modello Chlamydomonas reinhardtii sono state utilizzate su specie ad interesse commerciale, come l’alga oleaginosa Nannochloropsis gaditana, appartenente alla classe delle Eustigmatophyceae, di interesse applicativo nel campo della produzione di biocarburanti. N. gaditana è caratterizzata da un elevato contenuto lipidico (fino a 65-70% sul peso secco) e da un rapido tasso di crescita. In questo lavoro, è stata effettuata una mutagenesi chimica, ed è stato utilizzato un metodo basato sulla fluorescenza della clorofilla emessa per esaminare il gran numero di colonie, isolando quelle con variazioni in parametri fotosintetici. 2100 cloni indipendenti sono stati analizzati, tre cloni sono risultati interessanti per la riduzione delle dimensioni dell’antenna fotosintetica del PSII o per un basso livello di dissipazione termica dell’energia luminosa (NPQ). E’ stato caratterizzato il fenotipo dei mutanti selezionati e valutata l’efficienza di utilizzo dell’energia luminosa. Il fenomeno di Non-Photochemical-quenching (NPQ) è un meccanismo fisiologico chiave per tutte le cellule fotosintetiche. È essenziale per la corretta modalità di funzionamento del processo fotosintetico, perché permette di controllare il livello di clorofille tripletto e la produzione di ROS nel cloroplasto. Il processo NPQ è un meccanismo fotoprotettivo complesso: può cambiare nello stesso gruppo filogenetico algale, in base alla condizioni ambientali in cui si sono evolute. Nel processo di NPQ, diversi fattori chiave agiscono insieme: DpH transmembrana, pigmenti e proteine quencher. Il fattore più importante coinvolto nell’NPQ in C. reinhardtii è la proteina LhcSR, che può interagire con altre proteine quencher accessorie, come LHCBM1 e LHCBM6. In questa tesi è stato dimostrato che si può incrementare la produttività algale diminuendo il livello di dissipazione termica dell’energia luminosa (Non-Photochemical-Quenching NPQ) garantendo contemporaneamente un minimo livello di fotoprotezione. Con una migliore comprensione del meccanismo NPQ è possibile trovare il modo per domesticare le microalghe, eliminando il divario fra biomassa teorica e realmente ottenibile.

Photosynthesis is the main solar energy converting system on our planet. In all photosynthetic organisms, photosynthesis takes place in the thylakoid membranes of chloroplasts, which are capable of converting solar energy into chemical energy to fix carbon dioxide into biomass, producing oxygen as a byproduct. Light energy, which intensity and spectral quality change continuously in the environment, can also be harmful since excess irradiances can determine the photosystems over-excitation, with the consequent production of Reactive Oxygen Species (ROS). ROS are toxic molecules that can seriously damage the chloroplast as well as the entire cell. In order to avoid this critical situation, several photoprotective mechanisms evolved. Light harvesting and energy conversion by charge separation occur at the level of membrane protein complexes called Photosystems. In eukaryotic systems, the Light Harvesting Complex (LHCs) multigene family constitutes the pigment binding antenna system of photosystems. LHCs play two fundamental roles in photosynthesis: light harvesting and regulation of excitation energy. The fastest and most important photoprotective inducible strategy is the activation of the thermal dissipation of light energy absorbed in excess, a mechanism called Non-Photochemical-Quenching (NPQ), which is triggered by the generation of a pH gradient across thylakoid membranes. In vascular plants, NPQ depends on the Lhc-like protein PSBS, while a different polypeptide called LhcSR, is required in algae as the model species Chlamydomonas reinhardtii. LhcSR is a chlorophyll and xanthophyll-binding protein, responsive to low pH and it is a strong quencher of Chl excited states, exhibiting a fast fluorescence decay. In microalgae, the NPQ mechanism is really influent: up to 80% of absorbed light energy can be dissipated as heat, with consequent loss of light use efficiency and biomass productivity in favor of photoprotection. This explains the importance of the study of NPQ, in order to find a promising way of domestication to improve overall algal productivity. Algae domestication is an indispensible step for their commercial applications, such as production of biomass for human/animal feeding or extraction of high-value chemicals and biofuels feedstock. For all these reasons, the central point of this thesis is the study of NPQ in microalgae. In the first part of the thesis, the NPQ mechanism was studied in detail in six different green algae, some are planktonic species, others live in aggregation on biofilm structures. The analysis takes into consideration fluorescence measurements, the change in the pigment profiling and the transmembrane DpH formation. From this investigation, the heterogeneity of the NPQ mechanism was demonstrated in green algae: the NPQ behavior was not related to the phylogeny of the algae but rather to the environmental selection pressure. Some green algae present a zeaxanthin-dependent-NPQ, like the vascular plants, while the correlation is absent in other algal species of the same phylogenic group. In a biologic system the productivity and biomass accumulation could be considerably increased by reducing the level of energy dissipation into heat. In order to demonstrate this theoretic hypothesis, the attention was focused on the study of the correlation between biomass production, heat dissipation (NPQ) and the accumulation of LhcSR, which is the crucial protein in triggering NPQ in the model species for algae research Chlamydomonas reinhardtii. Wild type strain and knockout mutants with reduced NPQ induction were grown simultaneously in a small scale photobioreactor, in different conditions of light intensity. The main conclusion of this work is that a mutant in the two genes coding for LhcSR3 subunit, with reduced NPQ induction, showed an improved capacity to convert photons into biomass than the WT. Therefore this is the demonstration that algal productivity can be increased by down-regulating NPQ. On the other hand a second mutant in which NPQ induction was completely abolished by knocking out also the gene coding for LhcSR1, showed a much lower productivity compared to WT: a minimal level of photoprotective quenching is thus necessary. Therefore our results demonstrate that evolution led Chalmydomonas reinhardtii cells to promptly switch upon high irradiance exposure to energy converting states with low efficiency in order to safely dissipate the energy absorbed in excess through heat. Chloroplasts in a highly quenched state are less efficient in photosynthetic biomass production, but they are in a safer photoprotective state with a low risk for Photoinhibition. In Chlamydomonas reinhardtii NPQ is fully dependent on the presence of the LhcSR polypeptide. In addition there are likely other proteins involved among members of the LHCBM family, namely Light Harvesting Complexes subunits predominantly associated with PSII. In Chlamydomonas reinhardtii there are nine highly conserved LHCBM genes: some of them exert a specific role, with a well defined, non-redundant function despite their high homology, while for other genes their functions are still unclear. For example, a role in NPQ was demonstrated for LHCBM1 protein, likely as a partner for the main regulator element LhcSR3, while LHCBM2/7 was reported to be involved in state transitions induction. The specific function of LHCBM4, LHCBM6 and LHCBM8 polypeptide is still unknown, for all these reasons, in this work the biochemical and spectroscopic features of LHCBM4, LHCBM6 and LHCBM8 were first analyzed in the recombinant proteins in vitro and their physiologic function was then studied in vivo by a reverse-genetic approach using amiRNA strains. The results demonstrate the quenching activity of LHCBM4, LHCBM6 and LHCBM8, suggesting their involvement in photoprotective mechanisms. As shown previously, the modulation of the NPQ phenomena, is a key factor for microalgae domestication. The information obtained for the model organism Chlamydomonas reinhardtii was then applied in the case of commercial interesting species. The Eustigmatophyceae oleaginous alga Nannochloropsis gaditana is important for biofuel production: it is characterized by a high oil content (up to 65-70% oil on dry weight) and fast growth in a wide range of conditions. In this work a chemical mutagenesis was done, and time-resolved chlorophyll a fluorescence imaging was used to investigate a large number of colonies and to isolate those with changes in photosynthetic parameters. We analyzed 2100 independent clones, among them we identified three interesting clones for low antenna size of PSII or for a low energy quenching dissipation. Several experiments were done to characterize the phenotype of the selected mutants in order to evaluate their possible increase in light use efficiency. Non-Photochemical-Quenching (NPQ) is a key physiologic mechanism in all photosynthetic cells. It is essential for the correct mode of operation of the photosynthetic process controlling the level of chlorophyll triplets and the ROS production in the chloroplast. The NPQ process is a complex photoprotective mechanism: it can change in the same phylogenetic group of algal species in dependence of the environmental pressure. There are several key factors, which act together, the transmembrane DpH, the xanthophyll pigments, and quencher protein(s). The most important actor involved in NPQ in C. reinhardtii is LhcSR, which can interact with accessory LHC quencher proteins, like LHCBM1 and LHCBM6. In this thesis there is a demonstration that algal productivity can be increased by down-regulating NPQ ensuring to the cells a minimal level of photoprotective quenching. With a better understanding of the NPQ mechanism it is possible to find a way for algae domestication, in order to fill the gap between the theoretic biomass estimation and the real obtainable biomass yield.