Prokaryotic and eukaryotic expression systems for the production of recombinant proteins and nanoparticles for research and bio-industry

Gli organismi viventi sono in grado di produrre complesse strutture biologiche con funzioni specifiche per il loro metabolismo utilizzabili in settori industrali e di ricerca. In questo contesto le moderne tecnologie biotecnologiche sfruttano sistemi procariotici ed eucariotici per l'espressione di proteine ricombinanti, vaccini, anticorpi e nanoparticelle. In particolare il settore delle nanotecnologie sta conoscendo in questi ultimi anni un forte sviluppo e prodotti a base di nanoparticelle sono già stati approvati per la diagnostica e la terapia mentre altre sono attualmente in fase di sperimentazione clinica. In questa tesi, è stata analizzata la possibilità di utilizzare diversi sistemi biologici per l’ espressione di proteine ricombinanti o di nanoparticelle sfuttando sia sistemi procariotici che eucariotici. La prima parte del presente eleborato di tesi riguarda la purificazione di nanoparticelle magnetiche chiamate magnetosomi da Magnetospirillum gryphiswaldense , un batterio magnetotattico microaerofilo, nonché la successiva applicazione delle stesse come possibili agenti di contrasto in analisi NMR o come agenti terapeutici per termoterapia anti-tumorale. Nel presente elaborato di tesi è stato ottimizzato il metodo di coltura di M.gryphiswaldense, realizzando un'efficiente purificazione dei magnetosomi in lunghe catene, successivamente analizzati nelle loro caratteristiche chimico-fisiche (analisi DLS, TEM, misure di relassività e MRI) confermando la bontà come mezzi di contrasto e succesivamente impiegate in vivo come efficaci agenti terapeutici per ipertermia. Nella seconda parte della tesi invece è stato sviluppato un sistema eucariotico per la produzione di un’importante proteina di membrana, LHCSR1, coinvolta nel delicato processo di regolazione della fotoprotezione in alghe e muschi. In particolare la proteina LHCSR1 del muschio Physcomitrella patens è stata espressa in due sistemi eucariotici ,Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum realizzando l’isolamento della proteina e la preliminare determinazione delle principali proprietà spettroscopiche e biochimiche.

Living organisms can produce complex structures with specific functions for their metabolism that are used in a range of bio-industry and research activities. Biotechnology exploits prokaryotic and eukaryotic systems for expression of recombinant proteins, vaccines and antibodies as well as nano-structures. Indeed a number of nanoparticle-based products have been approved for diagnostics and therapeutics and more are currently under clinical trials. In this thesis work, the possibility of using different expression systems for the preparation of bio-products has been exploited. The first part of this thesis concerns the purification of magnetic nanoparticles called magnetosomes from Magnetospirillum.gryphiswaldense, a magnetotactic microaerophilic bacterium. Subsequently these nanoparticles have been tested as contrast agents in NMR analysis or as therapeutic agents for tumor thermotherapy. The chemical-physical properties of magnetosomes efficiently purified have been studied, confirming the goodness of these nanoparticles as contrast agents. Then magnetosomes has been tested in thermotherapy in vitro and in vivo against two cancer cell lines. In the second part of the thesis instead has been developed a system for the production of an important eukaryotic membrane protein, LHCSR, involved in the delicate process of regulation photoprotection in algae and mosses. In particular the protein LHCSR1 from the moss Physcomitrella patens has been efficiently expressed in two eukaryotic systems, Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum realizing its isolation from thylakoid membrane and the preliminary determination of its biochemical and spectroscopic properties.