A cytoplasmic tyrosine kinase‐based signaling pathway regulating cytoskeleton dynamics and podosome formation in macrophages

I podosomi sono strutture protrusive presenti in diversi tipi cellulari, ad esempio in macrofagi, e sono importanti per la capacità di tali cellule di degradare la matrice cellulare e migrare attraverso barriere cellulari e l’interstizio. Il meccanismo attraverso cui avviene il rimodellamento del citoscheletro che sta alla base della formazione e dell’assemblaggio dei podosomi è noto solo in parte, ma negli ultimi anni sta emergendo l’importante del ruolo delle proteine tirosin-chinasi citoplasmatiche delle famiglie Src ed Abl. In particolare è stato dimostrato che Abl è in grado di fosforilare Sos1, una proteina appartenente alla famiglia dei cosìdetti GEF (“Guanine Exchange Factor”), e che tale fosforilazione in tirosina è sufficiente per indurre l’attivazione di Rac, un membro della famiglia delle RhoGTPasi. Poiché è già noto che Rac gioca un ruolo importante nella formazione di podosomi in cellule mieloidi, abbiamo deciso di approfondire questo aspetto, andando a vedere se anche Sos1 è coinvolto nei processi di formazione e nel funzionamento dei podosomi nei macrofagi. Prima di tutto abbiamo osservato che l’espressione ectopica di Abl o di Fgr, una chinasi della famiglia Src maggiormente espressa nelle cellule mieloidi, induce la fosforilazione in tirosina di Sos1 in cellule Cos-7. Inoltre in macrofagi murini Hck e Fgr, entrambi membri della famiglia Src, sono necessari non solo per la fosforilazione di Abl e Sos1, ma anche per la loro associazione. Successivamente abbiamo osservato che Sos1 ed Abl sono localizzate nei podosomi di macrofagi murini e umani e che il silenziamento genico di entrambe le proteine porta al disassemblaggio di tali strutture in macrofagi murini e ad una ridotta capacità di degradare una matrice extracellulare e di migrare attraverso un monostrato di cellule endoteliali. Infine, se paragonati a cellule controllo, i macrofagi in cui l’espressione di Sos1 o Abl è stata silenziata o che sono stati trattati con inibitori di Abl mostrano una minore capacità di invadere in sferoidi tumorali, rimanendo invece negli strati più esterni di tali strutture. E’ importante sottolineare che le cellule neoplastiche possiedono strutture simili ai podosomi, chiamate invadopodi, fondamentali per la loro capacità di migrare e coinvolte nei processi di metastasi. Poiché si è visto che sia Src che Abl sono fondamentali anche per la formazione di invadopodi, i nostri studi suggeriscono che andando a bloccare la trasduzione del segnale dipendente da queste tirosin-chinasi e Sos1-Rac si potrebbe teoricamente ridurre la capacità invasiva e metastatica delle cellule tumorali, ma anche inibire il reclutamento di cellule mieloidi nel tumore. Quest’ultimo aspetto è particolarmente interessante, in quanto negli ultimi anni il reclutamento dei macrofagi nei tumori è emerso come uno dei tratti distintivi di tali malattie, e quindi il bloccare questa via di trasduzione del segnale potrebbe permetterci di controllare sia le capacità invasive delle cellule neoplastiche che i processi infiammatori che in alcuni casi favoriscono l’accrescimento e la formazione dei tumori.

Podosomes are protrusive structures implicated in macrophage extracellular matrix degradation and three-dimensional migration through cell barriers and the interstitium. Podosome formation and assembly are regulated by cytoskeleton remodeling requiring cytoplasmic tyrosine kinases of the Src and the Abl families. Considering that Abl has been reported to phosphorylate the guanine nucleotide exchange factor (GEF) Sos1, eliciting its Rac-GEF activity, and Rac regulates podosome formation in myeloid cells and invadopodia formation in cancer cells, we addressed whether Sos1 is implicated in podosome formation and function in macrophages. We found that ectopically expressed Abl or the Src kinase Fgr phosphorylate Sos1, and the Src kinases Hck and Fgr are required for Abl and Sos1 phosphorylation and Abl/Sos1 interaction in macrophages. Sos1 localizes to podosomes in both murine and human macrophages and its silencing by siRNA results in disassembly of murine macrophage podosomes and a marked reduction of GTP- loading on Rac. Matrix degradative capacity and trans-migration through an endothelial cell monolayer of Sos1-silenced macrophages were either suppressed or markedly inhibited, respectively. Additionally, Sos1- or Abl-silenced macrophages, or macrophages treated with the selective Abl inhibitor imatinib mesylate had a reduced capability to migrate into breast tumor spheroids, the majority of cells remaining at the margin and the outer layers of the spheroid itself. To note, neoplastic cells form podosome-like structures, called invadopodia, that have been implicated in cancer cell migratory ability and metastatic potential. Considering that both Src and Abl are implicated in cancer cell invadopodia formation, our studies suggest that targeting the SFKs/Abl/Sos1/Rac pathway may result in reduction of cancer cell invasive capacity but also of myeloid leukocyte recruitment into the tumor. Notably, macrophage recruitment into tumors has emerged as one of the hallmarks of cancer, thus pointing to the exciting possibility that targeting this pathway may represent a double-edged sword to control both cancer invasive capacities and cancer-related inflammation.