Oxidative stress induces STAT3 S-glutathionylation and impairs its phosphorylation: in vivo and in vitro study

STAT3 è un fattore di trascrizione costitutivamente attivato in numerosi tumori solidi ed ematologici. STAT3 attivato è coinvolto nell’oncogenesi, stimola la proliferazione cellulare e resistenza all’apoptosi, promuove l’angiogenesi, l’invasione e la migrazione del tumore. Per questo motivo lo STAT3 è riconosciuto come un potenziale target terapeutico. In questo lavoro, è stato identificato un sesquiterpene lattone di origine naturale, la cinaropicrina, come potente inibitore di STAT3 sia indotto da IL-6 che costitutivamente attivato (IC50=12 µM). La cinaropicrina si comporta come accettore di Michael e induce un calo della concentrazione di glutatione (GSH) intracellulare in modo dose- e tempo- dipendente. La variazione dello stato redox intracellulare induce S-glutationilazione di STAT3 e previene la fosforilazione in tirosina-705 di STAT3 e quindi la sua attivazione. In cellule DU145, che esprimono STAT3 costitutivamente attivo, il trattamento con cinaropicrina sopprime Bcl-2 e Survivina, due geni anti-apoptotici e STAT3-dipendenti, e induce morte cellulare. L’analisi dei marker di PI/Annexina-V, il taglio della PARP e la formazione di DNA ladder, dimostrano che la morte indotta della cinaropicrina è di tipo apoptotico. Inoltre, questo composto sensibilizza le cellule al trattamento con cisplatino o docetaxel, due chemioterapici utilizzati in terapia, mostrando effetto sinergico. Per chiarire il meccanismo molecolare della S-glutationilazione di STAT3 sono stati eseguiti studi in vitro, utilizzando la proteina ricombinante. Questi studi dimostrano che il trattamento combinato con la diamide, un ossidante specifico per i gruppi tiolici, e il GSH induce S-glutationilazione di STAT3 e che questa modifica post-trasduzionale è completamente eliminata dal trattamento con ditiotreitolo. Questi risultati indicano che la S-glutationilazione di STAT3 è in relazione con la formazione di disulfuri misti. Inoltre, saggi di attività chinasica dimostrano che la S-glutationilazione impedisce la fosforilazione di STAT3. Tale fenomeno potrebbe essere legato alla capacità del GSH, un gruppo ingombrante e carico negativamente, di influenzare la struttura di STAT3 e di interferire l’accessibilità della tirosina-705 alla chinasi. Analisi di spettrometria di massa hanno identificato due residui di cisteina maggiormente glutationilate, cisteina-328 e cisteina-542. Studi di mutagenesi sito-specifica e saggi chinasici hanno confermato l’importanza di entrambi i residui di cisteina nel complesso meccanismo di redox-regolazione di STAT3. In conclusione, i dati presentati in questo lavoro confermano la redox-regolazione di STAT3 in vivo ed in vitro e contribuiscono a chiarire il meccanismo molecolare di glutationilazione di STAT3.

STAT3 is a transcription factor constitutively activated in highly malignant solid and hematological tumor. Activated STAT3 may participate in oncogenesis by stimulating cell proliferation and inducing resistance to apoptosis, as well as promoting tumor angiogenesis, invasion, and migration. The tight association of STAT3 activation with transformation and tumor progression makes STAT3 a potential therapeutic target. In this work, we identify the naturally occurring sesquiterpene lactone cynaropicrin as a potent inhibitor of both IL-6-inducible and constitutive STAT3 activation (IC50=12 µM). Cynaropicrin, that contains α-β unsatured carbonyl moiety and functions as potent Michael reaction acceptor, induces dose- and time-dependently the drop in intracellular glutathione (GSH) concentration. Finally, the glutathione ethylene ester (GEE), the cell permeable GSH form, prevents the inhibitory action of cynaropicrin on STAT3 tyrosine phosphorylation. The disturbance in the intracellular redox state induces S-glutathionylation of STAT3. STAT3 inhibition leads to the suppression of two anti-apoptotic genes, Bcl-2 and Survivin, in DU145 cells that constitutively express active STAT3. This event may be responsible of the decline in cell viability after cynaropicrin treatment. As revealed by PI/Annexin-V staining, PARP cleavage and DNA ladder formation, cynaropicrin cytotoxicity is mediated by apoptosis. Moreover, we found that cynaropicrin potentiated cytotoxic effect of two well-establish chemotherapeutic agent, cisplatin and docetaxel. Many reports support the idea that STAT3 S-glutathionylation might represent the key event in redox STAT3 modulation. In order to clarify S-glutathionylation of STAT3 we performed an in vitro study. We demonstrated that the combined treatment with diamide, a thiols specific oxidant, and GSH induces S-glutathionylation of STAT3 in the recombinant purified form. This effect was completely reversed by treatment with dithiothreitol, indicating that S-glutathionylation of STAT3 was related to formation of protein-mixed disulfides. Since STAT3 was glutathionylated in the presence of oxidants, we examined whether this modification might affect STAT3 phosphorylation using in vitro kinase assay. As expected, S-glutathionylation significantly decreased the level of STAT3 tyrosine. The addition of the bulky negatively charged GSH moiety impairs JAK2-mediated STAT3 phosphorylation very likely interfering with tyrosine accessibility thus affecting protein structure and function. Mass mapping analysis identifies two glutathionylated cysteine residues, Cys328 and Cys542. Site direct mutagenesis and in vitro kinase assay confirm the importance of both cysteine residues in the complex redox regulatory mechanism of STAT3. Cells expressing mutant were resistant in this regard. The data presented herein confirmed the occurrence of a redox-dependent regulation of STAT3 and identified the more redox- sensitive cysteines of STAT3 protein to S-glutathionylation.