MOLECULAR AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN RBM20: EVIDENCE OF ITS INVOLVEMENT IN REGULATING ALTERNATIVE SPLICING OF FORMIN FHOD3

Lo splicing alternativo è un processo post-trascrizionale estremamente regolato che espande il potenziale espressivo dei genomi. Sono pochi i regolatori umani dello splicing alternativo tessuto-specifici a essere stati identificati e funzionalmente caratterizzati. Studi di gene-mapping e linkage genetico hanno dimostrato che mutazioni nel gene di RBM20 causano cardiomiopatia dilatativa. In questa tesi è presentata e discussa la caratterizzazione funzionale di una ribonucleoproteina specifica del cuore conosciuta come RNA Binding protein 20 (RBM20). E’ stata clonata la regione codificante del gene da trascritti espressi nel tessuto cardiaco umano. Per identificare i domini funzionali necessari alla sua distribuzione nucleare, sono stati espressi peptidi tronchi di RBM20 fusi alla proteina verde fluorescente GFP ed analizzati per la loro distribuzione sub-cellulare. E’ stata così identificata una regione necessaria alla localizzazione nucleare che comprende due domini di legame all’RNA. E’ stata analizzata la tessuto specificità della proteina RBM20 in tessuti e linee cellulari umane, confermando la maggior espressione in tessuti muscolari e cardiaci. Allo scopo di dimostrare il ruolo di RBM20 nella regolazione dell’espressione di geni coinvolti nel processo di organizzazione dei sarcomeri, è stato analizzato Il coinvolgimento di RBM20 negli eventi di splicing alternativo degli esoni del gene FHOD3. Si è dimostrato che, in presenza di quantità crescenti di RBM20, i profili di espressione delle varianti di splicing di FHOD3 sono modificati. Il legame di RBM20 ai trascritti di FHOD3 ha trovato conferma nell’analisi d’interazione RNA-proteina in immunocomplessi selezionati per la presenza di RBM20. Nel loro insieme, i risultati ottenuti nel corso di questo studio hanno dimostrato, sperimentalmente, che la selettività dei trascritti regolati da RBM20 include un fattore chiave nell’assemblaggio dei filamenti di actina nelle strutture dei sarcomeri, rappresentato dalla proteina FHOD3 della famiglia delle formine. Questo studio può contribuire alla comprensione dei meccanismi che portano allo sviluppo cardiaco e che, se alterati, portano a difetti molecolari alla base della cardiomiopatia dilatativa.

Alternative splicing is an extremely regulated post-transcriptional process that enhances the genome expression complexity. Very few human tissues specific regulators of alternative splicing have been identified and functionally characterized. Genetic linkage and gene-mapping studies have demonstrated that mutations in an heart specific ribonucleoprotein known as RNA Binding protein 20 (RBM20) cause dilated cardiomyopathy. In the present thesis the molecular and functional characterization of RBM20 is presented and discussed. RBM20 open reading frame from human cardiac tissue has been cloned in expressing vectors. Domains that are necessary for nuclear distribution have been identified by dissection of the RBM20 functional domains through the production and analyses of the sub-cellular distribution of GFP- RBM20 truncated peptides. RBM20 tissue specificity was analyzed in human tissues and cell lines. The involvement of RBM20 in alternative splicing events of tissues regulated exons was analyzed, selecting the FHOD3 regulator of actin filaments as RBM20 specific transcript target. Alternative splicing switch in FHOD3 transcripts was observed in presence of RBM20 over-expression in transfected cells. FHOD3 interaction with RBM20 was demonstrated by RIP experiment. The results have produced evidences that RBM20 is a key factor in determining the issue- splicing signature of FHOD3. This study contributes to the knowledge of the extensive mechanisms that allow to the heart development and, when altered, may lead to molecular defects in dilated cardiomyopathy.