IN-DEPTH CHARACTERIZATION OF THE SECRETOME OF PANCREATIC CANCER STEM CELLS BY iTRAQ-BASED SHOTGUN PROTEOMICS AND IDENTIFICATION OF POTENTIAL MARKERS FOR EARLY DIAGNOSIS OF PANCREATIC CANCER.

L’adenocarcinoma pancreatico rappresenta la quarta causa di morte per cancro nel mondo. La prognosi per i pazienti affetti da questo tipo di cancro è scarsa, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi che risulta essere inferiore al 5%. Uno dei motivi principali di questo alto tasso di mortalità è la mancanza di efficaci marcatori diagnostici e prognostici. Diverse ricerche hanno dimostrato che il tumore pancreatico è composto da una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali, che sono caratterizzate da auto-rinnovamento, crescita indipendente da ancoraggio, capacità proliferativa a lungo termine, e resistenza alla chemioterapia. Diversi studi hanno evidenziato un ruolo centrale delle cellule staminali tumorali nella tumorigenesi,nella formazione di metastasi, e nella resistenza ai trattamenti di radioterapia e chemioterapia. Tali osservazioni hanno comportato la necessità di studiare ed identificare le caratteristiche biologiche delle cellule tumorali staminali in modo da incrementare le conoscenze per la diagnosi e la prognosi del tumore pancreatico. Lo scopo del presente progetto di ricerca è basato sull’identificazione di marcatori per la diagnosi precoce del tumore pancreatico attraverso lo studio delle cellule tumorali staminali. In questo studio, le cellule tumorali staminali sono state ottenute in vitro attraverso l’utilizzo di un mezzo di coltura selettivo, a partire da cinque linee cellulari stabilizzate di adenocarcinoma pancreatico. Le cellule staminali tumorali pancreatiche così originate sono state caratterizzate per la resistenza a cinque agenti chemioterapici, e per l’espressione di marcatori di superficie tipici delle cellule staminali e della transizione epitelio-mesenchimale. Inoltre è stato dimostrato in vivo che queste cellule tumorali staminali pancreatiche, sono in grado di dare origine ad una massa tumorale più grande rispetto alle cellule tumorali parentali, oltre a possedere una maggiore attività metastatica. I risultati ottenuti hanno dimostrato la capacità di isolare in vitro le cellule staminali tumorali pancreatiche da differenti linee cellulari tumorali e che tali cellule sono in grado di resistere all’azione di vari agenti antitumorali. Questa variabilità rende questo modello molto rilevante per una conoscenza più approfondita della biologia del tumore pancreatico, e per la scoperta di nuovi marcatori o nuovi composti terapeutici. Diversi studi hanno riportato l’importanza delle proteine secrete dalle cellule tumorali come oggetto di studio per la scoperta di nuovi marcatori data la loro elevata presenza nel siero e nel plasma dei pazienti. Il nostro studio si è quindi focalizzato sull’analisi delle differenze presenti a livello del secretoma delle cellule staminali tumorali e della controparte parentale. È stata realizzata un’analisi proteomica basata sulla tecnica iTRAQ del secretoma delle cellule staminali tumorali e della linea di derivazione. Quest’analisi ha permesso l’identificazione di 112 proteine secrete, di cui 43 maggiormente abbondanti nel secretoma delle cellule tumorali staminali pancreatiche. Attraverso un’analisi in silico del secretoma delle cellule staminali tumorali pancreatiche è stata dimostrata una predominanza di proteine coinvolte in processi quali glicolisi e gluconeogenesi, via del segnale dei pentosi fosfati, rimodellamento delle giunzioni epiteliali, apoptosi myc mediata e via del segnale di ERK5. Per scoprire nuovi marcatori per la diagnosi precoce del tumore pancreatico tra queste molecole secrete, è stata determinata la presenza delle tre proteine maggiormente secrete dalle cellule tumorali staminali pancreatiche nei sieri di 100 pazienti e di 20 campioni sani. È stato dimostrato che i livelli di ceruloplasmina (proteina risultata maggiormente secreta) sono molto più elevati nei pazienti affetti da tumore pancreatico allo stadio precoce rispetto ai campioni sani; inoltre dal confronto con il CA19-9, l’attuale marcatore tumorale usato per il tumore pancreatico, in più del 50% dei pazienti negativi per quest’ultimo, i livelli di ceruloplasmina sono risultati molto elevati. Infine la combinazione ceruloplasmina/ CA19-9 ha mostrato un incremento della sensibilità rispetto al CA19-9 usato come marcatore singolo. Questi risultati hanno suggerito che la ceruloplasmina potrebbe essere un potenziale marcatore complementare al CA19-9 nella diagnosi del tumore pancreatico. Lo studio delle cellule staminali tumorali pancreatiche e l’analisi delle molecole secrete si è rivelato essere un approccio con un forte potenziale per approfondire le conoscenze nella diagnosi del tumore pancreatico e per identificare nuovi potenziali marcatori.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fourth most common cause of cancer-related death in the world. The prognosis for patients affected by this type of cancer is poor, with the 5-year survival rate after diagnosis being less than 5%. One major reason for this high mortality is the lack of effective diagnostic and prognostic markers. Emerging research has demonstrated that PDAC tumours contain a small sub-population of cancer stem cells (CSCs), which are characterized by self-renewal, anchorage independent growth, long term proliferative capacity, and chemotherapy resistance. These observations render imperative the identification of the specific biological features of CSCs, in order to improve PDAC diagnosis and prognosis. The present research PhD project aim was focused on the identification of markers for early diagnosis of PDAC through the analysis of cancer stem cells. In this investigation, CSCs were obtained ,by using a selective medium, from five out of nine PDAC cell lines; after the formation of spheres which represent the first evidence of staminal traits, CSCs have been characterized for the expression profile of different markers by using FACS and Western blot analysis. CSCs showed increased expression of the stem cell markers EpCAM and CD44v6, decreased expression of epithelial marker E-cadherin, and higher resistance to five anti-cancer drugs. Finally, PDAC CSCs injected into nude mice developed a larger subcutaneous tumour mass and showed a higher metastatic activity compared to parental cells. The results obtained demonstrated the ability to isolate CSCs from different PDAC cell lines and that these cells are differentially resistant to various anticancer agents. This variability render them a model of great importance to deeply understand pancreatic adenocarcinoma biology, to discover new biomarker and to screen new therapeutic compounds. Since it is known that cells secrete proteins for cell-cell communication and that the specificity of secreted proteins can direct cells to distinct microenvironment, it has been analyzed the difference in protein secretion between CSCs and parental cells. It has been performed an iTRAQ-based mass spectrometry proteomic analysis of Panc1 and Panc1 CSCs secretomes identifying a total of 112 secreted proteins, of which 43 were found to have higher abundance in the secretome of Panc1 CSCs as compared to parental cells. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) analyses of Panc1 CSCs secretome showed a predominance of proteins involved in glycolysis and gluconeogenesis, pentose phosphate pathway, signalling of glioma invasiveness, of myc-mediated apoptosis, and of ERK5, and remodelling of epithelial adherent junctions. To discover novel potential markers for PDAC diagnosis, it has been analysed the presence of the three proteins that were over-secreted from Panc1 CSCs, i.e. ceruloplasmin, galectin-3, and myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS) in 100 pancreatic cancer patient and 20 control sera. It has been found that ceruloplasmin and MARCKS levels, were significantly higher in PDAC patient sera compare to healthy controls. In particular, ceruloplasmin was more abundant in patients at an early stage of PDAC. Furthermore, the combination of ceruloplasmin and CA19-9, the current standard serum tumour marker for PDAC, showed an improved area under the receiver operating characteristic curve compared to CA19-9 alone and ceruloplasmin levels were higher than controls in more than 50% of patients negative for CA19-9. This finding suggested that ceruloplasmin might prove to be an important complementary biomarker for CA19-9 in PDAC diagnosis. The study of CSCs and the analyses of secreted molecules turned out to be an approach with a strong potential to improve PDAC biology knowledge and to identify new potential early markers.