FUNCTIONAL ANALYSIS OF A PUTATIVE DOWNY MILDEW DEFENCE GENE IN GRAPEVINE: STABLE TRANSFORMATION OF VITIS VINIFERA WITH VITIS RIPARIA ATL2 AND CHARACTERIZATION OF THE ATL GENE FAMILY IN GRAPEVINE.

La vite è una delle più importanti piante da frutto coltivate nel mondo ed il suo valore economico è per la maggior parte dovuto alla produzione vitivinicola. La totalità delle piante coltivate sul territorio Europeo appartiene alla specie Vitis vinifera L., una pianta in grado di produrre uva di elevata qualità ma purtroppo è suscettibile a varie malattie, che causano rilevanti perdite di raccolto in tutto il mondo. Nonostante la disponibilità di prodotti fitosanitari in grado di controllare la maggior parte delle patologie della vite, le problematiche agro-ecologiche legate all’utilizzo di prodotti chimici in agricoltura hanno incoraggiato la comunità scientifica a ricercare metodi alternativi per il controllo dei patogeni in campo, cercando di ridurre le influenze sia economiche che ecologiche dei fitofarmaci sulla viticoltura. Nello specifico è noto che alcune specie selvatiche di vite, originarie del Nord America e dell’Asia, posseggono vari livelli di resistenza nei confronti di diversi patogeni. Nonostante queste fonti naturali di resistenza siano state utilizzate in passato per la produzione di ibridi interspecifici resistenti, nessuno di questi è stato totalmente accettato dai produttori vitivinicoli a causa dei numerosi difetti organolettici legati alla persistenza delle caratteristiche tipiche delle viti selvatiche. Un significativo passo in avanti è stato compiuto nel 2007, anno in cui è stato completa il sequenziamento del genoma di Vitis vinifera L. Da allora, una più profonda conoscenza delle ragioni genetiche alla base delle caratteristiche delle bacche e della resistenza ai patogeni ha aiutato la comunità scientifica ad affrontare il problema della suscettibilità della vite ai patogeni mediante prevalentemente due approcci: la selezione assistita da marcatori (MAS) e la trasformazione genetica. Questo progetto di dottorato si è focalizzato sul secondo approccio, nello specifico siamo riusciti a produrre viti transgeniche caratterizzate da una maggiore resistenza nei confronti di Plasmopara viticola, l’agente eziologico della peronospora della vite. In precedenza il nostro gruppo di ricerca si era occupato dello studio delle differenze trascrittomiche in risposta all’infezione da P. viticola nella vite suscettibile (V. vinifera) ed in una naturalmente resistente (V. riparia). Otto geni, specificamente indotti solamente nella vite resistente in seguito all’infezione, sono stati identificati come simili ad ATLs (Arabidopsis toxicos en Levadura), una famiglia genica nota in altre specie per essere indotta da elicitori. VrATL2, un ortologo di Arabidopsis thaliana ATL2, è stato selezionato come promettente gene candidato per la trasformazione di vite. Dato che la famiglia genica ATL era sostanzialmente sconosciuta in vite, il primo passo è stato quello di definirne i membri. Utilizzando il caratteristico dominio RING-H2 come sonda per un’analisi PSI-Blast all’interno del genoma tradotto di V. vinifera cv. Pinot Noir abbiamo identificato tutti i trascritti appartenenti a questa famiglia genica in vite. La famiglia genica è quindi stata analizzata definendo le caratteristiche molecolari di ciascun membro, le relazioni filogenetiche e i profili di espressione genica in differenti tessuti e stadi di sviluppo di vite. Successivamente sono state messe a punto le tecniche per l’induzione ed il mantenimento di calli embriogenetici di vite e quindi abbiamo ottenuto la trasformazione stabile di piante di V. vinifera cv. Shiraz con un’espressione aumentata e costitutiva del gene VrATL2. Le piante rigenerate sono quindi state caratterizzate da un punto di vista molecolare mediante analisi di Southern blot e Real Time qPCR, in modo da definire precisamente il numero di inserzioni e l’effettivo livello di espressione del transgene. Siamo quindi passati alla fenotipizzazione delle piante transgeniche rispetto alla resistenza nei confronti di P. viticola mediante due differenti metodi: l’osservazione microscopica dell’area di sporulazione e il calcolo della stessa mediante un software di elaborazione di immagini. Con lo scopo di descrivere ulteriormente il fenotipo osservato, tre linee rappresentative sono state selezionate per studiare le differenze trascrittomiche, dovute alla presenza del transgene, mediante un esperimento di microarray. Infine nelle stesse piante è stato anche studiato il processo di infezione mediante l’osservazione microscopica dello stesso a differenti intervalli temporali. L’ultima parte di questo progetto di dottorato è stata dedicata allo studio delle regioni regolatrici del gene ATL2 in entrambe le specie di vite. Le due regioni sono state isolate del DNA genomico di V. vinifera e V. riparia e successivamente analizzate mediante software bioinformatici per predire la struttura dei promotori e la presenza di specifici elementi regolatori. Quindi l’effettiva capacità di promuovere la trascrizione di un gene reporter è stata verificata mediante l’analisi funzionale in piante modello: trasformazione transiente di Nicotiana Benthamiana e trasformazione stabile di Arabidopsis thaliana. Infine abbiamo curato la messa a punto di un database interrogabile di tutti gli elementi regolatori predetti nei promotori dei geni ATL in vite; questo database potrà in futuro fornire spunti utili per indirizzare ulteriori analisi funzionali di questa famiglia genica. In conclusione, i risultati ottenuti durante questo dottorato di ricerca hanno dimostrato che nonostante la trasformazione stabile di vite sia ancora una metodica lunga e laboriosa, tanto da scoraggiare esperimenti di analisi funzionale, l’accurata scelta di un gene candidato può portare a buoni risultati in termini di fenotipo atteso. Inoltre, ad oggi la trasformazione stabile resta sostanzialmente il metodo di eccellenza per le analisi funzionali in vite. In linea con quanto detto siamo riusciti a generare viti transgeniche caratterizzate dall’aumentata resistenza noi confronti di P. viticola mediante la sovra espressione costitutiva del gene ATL2 isolato da V. riparia. Nonostante siano necessari ulteriori esperimenti per confermare la durata della resistenza osservata e per valutare accuratamente il fenotipo delle piante trasformate, speriamo che in futuro questo approccio possa contribuire a sviluppare una difesa antiperonosporica più sostenibile.

Grapevine is one of the most important fruit crop in the world, with a high economic impact mainly due to the wine production. The European Vitis vinifera L. produces high quality grapes but is prone to several pathogens, which cause significant losses to viticulture worldwide. Even if chemical control is available for most of the diseases, agro-ecological concerns pushed the scientific community to search for alternative methods, in order to reduce both the environmental and economic issues associated to pest control. In particular several wild species of the genus Vitis from North America and Eastern Asia exhibit various levels of natural resistance towards distinct pathogens. Despite these natural resistance sources have been used to in the past to produce first resistant hybrids, none of them reached complete growers acceptance because of adverse organoleptic features. A significant step forward was achieved in the 2007, when the Vitis vinifera L. genome was completely sequenced. Since then the deeper knowledge of genetic determinants of both resistance and berry quality traits boosted the grapes scientific community in facing the Vitis susceptibility mainly by two different approaches: marker associated selection (MAS) breeding and genetic transformation. This PhD project was focused on the second approach, in particular we carried out the stable transformation of grapevine in order to enhance its resistance towards Plasmopara viticola, the causative agent of downy mildew. Transcriptomic responses to P. viticola in both the susceptible V. vinifera and the resistant V. riparia have been previously studied by our research group. Eight genes, specifically induced only in V. riparia upon the infection process, were identified as similar to ATLs (Arabidopsis Toxicos en Levadura), a gene family known to be rapidly induced by common elicitors. VrATL2, an ortholog of Arabidopsis thaliana ATL2, was selected as a promising candidate gene for stable grapevine transformation. As the ALT gene family was almost unknown in grapevine, the first step was the complete survey of the family members. The canonical RING-H2 domain was used as bite to search for putative ATLs within the translated genome of V. vinifera cv. Pinot Noir by PSI-Blast analysis. The resulting protein family was manually curated and analysed for specific molecular characteristics, phylogenesis and gene expression profiles in different grapevine tissues and developmental stages. Once set up the induction and maintenance of grapevine embryogenic material, we stably transformed V. vinifera cv. Shiraz producing plants with increased constitutive expression of VrATL2. The newly generated plants were molecularly characterised by Southern blot and Real Time qPCR analyses in terms of number of insertions and actual level of transgene expression respectively. The phenotyping of transformed plants for their resistance against P. viticola was carried out by means of two different methods: microscopical visual inspection and computational image analysis. The observed phenotype was further described analysing the transcriptomic changes in three selected transgenic lines by a microarray experiment and finally, on the same lines, the infection process was evaluated by microscopic observations of a time-course experiment. The last part of this PhD project was focused on the characterization of the ALT2 regulative regions from V. vinifera and V. riparia. After the bioinformatic analysis of the isolated regulative regions in terms of promoter structure and cis-acting elements, their ability to promote the transcription in heterologous systems was verified, by transient transformation of Nicotiana benthamiana and stable transformation of Arabidopsis thaliana. Lastly, we implemented the setup of a custom interrogable database of all cis-acting elements predicted for the ATL gene family in grapevine, which might facilitate further analysis within this family. In conclusion, this PhD project showed that even if stable transformation of grapevine remains an arduous and time-consuming task, and functional analysis are almost precluded, the accurate and informed choice of a candidate gene may provide good results in terms of expected phenotype. Moreover, the actual stable transgenic expression remains the most informative and plausible approach for functional analysis in V. vinifera plants. Indeed we were able to produce transgenic grapevines with enhanced resistance towards P. viticola by constitutive overexpression of the ATL2 gene. Despite further experiments are needed to confirm the durability of the observed resistance and to describe the associated phenotypic features over the time, we hope that in the future this approach could help in terms of sustainable agriculture and food safety.