Targeted Next Generation Sequencing of the Five Hemochromatosis Genes in Italian Patients with Iron Overload and Non-Diagnostic First Level Genetic Test: A Pilot Study

L’Emocromatosi Ereditaria (EE) è una delle malattie genetiche più comuni nella popolazione caucasica con un’incidenza di 5 malati su 1000 individui (0.5 %). La diagnosi precoce della malattia è di fondamentale importanza per il trattamento dei pazienti ed è stata notevolmente migliorata con la scoperta del gene HFE nel 1996 e con il successivo sviluppo di un semplice test genetico-molecolare delle mutazioni C282Y e H63D sul gene HFE. La maggior parte degli individui con EE sono omozigoti per la mutazione C282Y o eterozigoti composti C282Y/H63D, i due genotipi considerati diagnostici per l’Emocromatosi classica HFE-correlata. Tuttavia, essendo l’EEuna malattia geneticamente eterogenea, circa il 30% dei pazienti presenta forme di Emocromatosi non correlate al gene HFE e mutazioni in almeno altri quattro geni coinvolti nella modulazione dell’asse epcidina-ferroportina, i.e. HAMP, HJV, TFR2, SLC40A1, sono considerate responsabili dell’espressione della malattia in questi pazienti.Le mutazioni a carico di questi altri quattro geni sono considerate private, ovvero limitate a pochi individui, necessitando, per un’appropriata diagnosi molecolare, di tecniche di sequenziamento disponibili solo presso centri specializzati. Negli ultimi anni, lo sviluppo di metodiche di sequenziamento di “ultima generazione” sta semplificando tale approccio a costi progressivamente inferiori.Il presente progetto ha lo scopo di mettere a punto un test rapido e accurato per la diagnosi molecolare di EE “atipica”, che possa supportare i clinici che si confrontano con tali casi, colmando in tal modo un gap della pratica clinica attuale. In questo lavoro di tesi abbiamo studiato 47 pazienti con evidenti segni biochimici di sovraccarico di ferro (IO) e negativi per il test genetico di primo livello suggerendo la presenza di EE non correlata al gene HFE. I cinque geni dell’Emocromatosi sono stati catturati mediante la tecnologia Halo-Plex™ e successivamente sequenziati usando una piattaforma di ultima generazione (Illumina HiSeq 1000). Le reads sono state allineate contro il genoma umano di riferimento HG19 e successivamente analizzate mediante il software GoldenHelix™ per annotare tutte le varianti eventualmente coinvolte nella malattia. Nei pazienti con IO sono state trovate un numero consistente di nuove varianti non sinonime (usando strumenti bioinformatici che si basano su database disponibili incluso il progetto 1000 Genomes). Molte delle varianti trovate sono relativamente frequenti e presenti anche nei soggetti controllo, e quindi sono state considerate non patogenetiche. Dall’altro lato, alcune varianti rare (limitate a un singolo individuo o a un numero molto limitato di soggetti) sui geni SCL40A1, TFR2 e HFE sono state trovate in maniera esclusiva nei pazienti e otto di queste varianti non sono mai state riportate nei databasesdbSNPs, 1000, Genomes, OMIM e ESP. Queste nuove varianti rare sono in grado di spiegare la correlazione fenotipo/genotipo nei pazienti negativi per il test genetico di primo livello e quindi sono state considerate potenzialmente patogenetiche. La combinazione della tecnologia Halo-Plex™ con la piattaforma di sequenziamento di ultima generazione e con il software GoldenHelix™ sembra rappresentare un approccio adatto per una migliore caratterizzazione molecolare dei pazienti con EE “atipica” e per l’implementazione di un test genetico di secondo livello nei centri di riferimento specializzati. Tuttavia stabilire la rilevanza clinica delle nuove varianti genetiche ottenute mediante un approccio di questo tipo in una malattia prevalentemente autosomica recessiva come EE rimane un compito difficile che richiede ulteriori studi funzionali e collaborazioni su base nazionale/internazionale. Questo progetto inoltre si propone di contribuire ad una migliore caratterizzazione molecolare di un numero crescente di soggetti con EE e prevede anche la possibilità di eseguire il sequenziamneto dell’intero esoma in un numero limitato di casi con fenotipidi emocromatosi che al momento restano non spiegati.

Hereditary Hemochromatosis (HHC) is one of the most common genetic diseases in Caucasians, as it can involve up to 5 per 1,000 (0.5 percent) individuals. Early diagnosis is essential, and has greatly improved since the discovery of the HFE gene in 1996, with subsequent development of a simple genetic test for the common mutations C282Y and H63D. Indeed, the majority of HHC patients are C282Y homozygotes or C282Y/H63D compound heterozygotes, the genotypes that are considered diagnosticfor “classic” HFE-HHC. However, HHC is a genetically heterogeneous disease in which near 30 percent of patients do not have such genotypes, and are currently classified as having “non-HFE” HHC.Mutations in at least four other genes involved in modulation of the hepcidin-ferroportin axis, i.e. HAMP, HJV, TFR2, and SLC40A1 have been reported to contribute to the disease expressionin such patients. At variance with HFE, mutations in thesegenes are typically “private”, i.e. limited to just few individuals, making unfeasible the use of standardized tests for the molecular diagnosis. Recent breakthrough of new techniques collectively known as “Next Generation Sequencing” (NGS) allow DNA sequencing with unprecedented rapidity at constantly declining costs. This project was aimed to develop a targeted NGS-based testfor sequencing the five hemochromatosis genes,and then to explore its performance in unravelingpotentially pathogenic variants in HHC patients, particularly in those cases that remained unexplained after first level genetic test. We studied 47 patients with relevant biochemical signs of iron overload (IO) and non-diagnostic first level genetic test suggesting a possible “non-HFE” HHC. This was defined as the absence of the C282Y and H63D mutations, or simple heterozygosity for each of them, or even H63D homozygosis.The five HHC genes were captured by Halo-Plex™ technology, and then sequenced using a NGS platform (IlluminaHiSeq 1000). Sequenced reads were aligned against human reference HG19 and analyzed by GoldenHelix™ software to annotate all the variants possibly involved in the disease. In IO patients a large number of new non-synonymous variants (according to bioinformatics tools based on publicly available databases including the 1000-genomes project) were found. Many of them were relatively frequent and detected also in controls, thus being considered likely “non-pathogenic”, unless clearly enriched in patients. On the other hand, some rare variants (i.e. limited to a single or very few individuals), particularly in SCL40A1, TFR2, and HFE, were found exclusively in patients, and could be considered “potentially pathogenic”. Among the identified variants 8 were apparently new, i.e. not reported in the following databases: dbSNPs, 1000 genome, OMIM and ESP Databases. Importantly, new rare variants that explained good phenotype/genotype correlation in patients with negative first level genetic and considered to be potentially pathogenic were detected. The combination of the Halo-Plex™ approach with NGS platform and GoldenHelix™ algorithm appears a suitable approach for a better molecular characterization of patients with unexplained HHC phenotype, and could represent a good option for second level genetic testing in referral centers. However, establishing the clinical relevance of NGS-detected “novel” genetic variants in a prevalently autosomal recessive disorder like HHC remains a difficult task, requiring further functional studies and national/international collaborative efforts. This project is also expected to significantly contribute to better characterization of the molecular basis of HHC, and will include the possibility to perform Whole Exome Sequencing (WES) in few cases with currently unexplained HHC-like phenotypes.