I globuli rossi sono cellule anucleate altamente specializzate nel trasporto dell’ossigeno e dell’anidride carbonica. La membrana plasmatica che li circonda svolge un ruolo essenziale per il corretto svolgimento della loro funzione ed è costituita da un doppio strato di fosfolipidi e colesterolo all’interno del quale sono immerse numerose proteine integrali di membrana, tra cui la banda 3 risulta essere la più abbondante. La banda 3, oltre a consentire lo scambio di ioni cloro con ioni bicarbonato attraverso la membrana, riveste un ruolo fondamentale nella connessione con il network di proteine citoscheletriche (come le alfa-beta spettrine) attraverso l’interazione con il complesso multiproteico dell’anchirina e il complesso multiproteico della banda 4.1. Tali interazioni conferiscono agli eritrociti caratteristiche univoche di plasticità e stabilità meccanica che ne garantiscono la permanenza all’interno della circolazione periferica. In questo contesto le modificazioni post-traslazionali delle proteine, in risposta a molteplici stimoli cellulari, modulano rapidamente la loro funzione ed il loro stato conformazionale. Tra queste, la fosforilazione dei residui di tirosina (Tyr) o serina/treonina (Ser/Thr), finemente regolata da specifiche chinasi e fosfatasi, risulta essere cruciale in svariati processi cellulari, come ad esempio il controllo del volume cellulare, la stabilità meccanica della membrana o il trasporto di ioni attraverso di essa. Lo scopo del presente progetto di ricerca è stato quello di analizzare i sistemi di trasduzione del segnale coinvolti nell’omeostasi eritrocitaria, con particolare attenzione a due modelli di globuli rossi patologici. Nella prima parte della ricerca abbiamo valutato l’effetto della triplice terapia antivirale a base di interferone pegilato e ribavirina in combinazione con un inibitore di proteasi di prima generazione (Telaprevir o Boceprevir) sugli eritrociti di pazienti affetti da epatite C cronica. I risultati ottenuti dimostrano che la triplice terapia induce un’anemia sferocitica acquisita con un incremento della quota di beta adducina fosforilata. Ulteriori studi ci permetteranno di caratterizzare meglio il ruolo degli inibitori di proteasi sull’omeostasi cellulare, tenendo in considerazione che l’anemia è una delle maggiori limitazioni di questo approccio terapeutico. Nella seconda parte del progetto di ricerca abbiamo analizzato gli eritrociti di un modello murino transgenico knock out per Fyn, una chinasi della famiglia delle Src, che presentano le caratteristiche tipiche dei globuli rossi di pazienti con deficit di G6PD (glucosio 6-fosfato deidrogenasi). I nostri risultati dimostrano che Fyn è coinvolta nell’attivazione della G6PD e nel corretto funzionamento dei sistemi antiossidanti all’interno dei globuli rossi, in particolare nel pathway G6PD/NADP/Tioredossina reduttasi in relazione alla rigenerazione della perossiredossina 2 (Prx2) sia in eritrociti murini che umani.

Red blood cells (RBCs) are enucleated cells specialized in delivering oxygen to body tissues. RBC membrane organization, which is characterized by phospholipids and cholesterol bilayer, containing integral membrane proteins such as band 3 that links RBC membrane to the alpha-beta spectrin based cytoskeleton network through two multiprotein complexes. The ankyrin and band 4.1 multiprotein complexes bridge the membrane to the skeleton ensuring the dynamic changes and membrane mechanical stability required by the permanence of RBC in the peripheral circulation. Post-translational modifications (PTMs), such as phosphorylation, might rapidly modulate protein conformational state and interactions with neighbor proteins. Changes in either tyrosine (Tyr) or serine/threonine (Ser/Thr) protein phosphorylation state, through modulation of kinases and/or phosphatases, are involved in membrane functions such as cell volume regulation, membrane mechanical stability or membrane ion transport function. The aim of the present research work is to analyze signaling pathways involved in red cell proteostasis. We studied two different models of diseased red cells: 1) Red cells from patients with chronic C hepatitis undergoing to triplice anti-viral therapy 2) Red cells from a mouse model genetically lacking Fyn, a tyrosine kinase of the Src family kinase, which recapitulate red cell features of G6PD deficient erythrocytes Our results demonstrate that: - Triplice therapy induced an acquired spherocytic like anemia with increased phosphorylation of beta-adducin, worsened by ineffective erythropoiesis due to possible toxic effect of triplice therapy on erythropoiesis. - Fyn is involved in activation of G6PD. Future studies will be design to further characterize: - The role of protease inhibitors and red cell homeostasis since anemia is a major limitation of this therapeutic approach. - The role of Fyn in G6PD/NADP/Thioredoxin reductase pathway towards Prx2 in both mouse and human red cells.

ABNORMALITIES IN CELL SIGNALING AND RED CELL PATHOLOGIES

Lupo, Francesca
2015-01-01

Abstract

Red blood cells (RBCs) are enucleated cells specialized in delivering oxygen to body tissues. RBC membrane organization, which is characterized by phospholipids and cholesterol bilayer, containing integral membrane proteins such as band 3 that links RBC membrane to the alpha-beta spectrin based cytoskeleton network through two multiprotein complexes. The ankyrin and band 4.1 multiprotein complexes bridge the membrane to the skeleton ensuring the dynamic changes and membrane mechanical stability required by the permanence of RBC in the peripheral circulation. Post-translational modifications (PTMs), such as phosphorylation, might rapidly modulate protein conformational state and interactions with neighbor proteins. Changes in either tyrosine (Tyr) or serine/threonine (Ser/Thr) protein phosphorylation state, through modulation of kinases and/or phosphatases, are involved in membrane functions such as cell volume regulation, membrane mechanical stability or membrane ion transport function. The aim of the present research work is to analyze signaling pathways involved in red cell proteostasis. We studied two different models of diseased red cells: 1) Red cells from patients with chronic C hepatitis undergoing to triplice anti-viral therapy 2) Red cells from a mouse model genetically lacking Fyn, a tyrosine kinase of the Src family kinase, which recapitulate red cell features of G6PD deficient erythrocytes Our results demonstrate that: - Triplice therapy induced an acquired spherocytic like anemia with increased phosphorylation of beta-adducin, worsened by ineffective erythropoiesis due to possible toxic effect of triplice therapy on erythropoiesis. - Fyn is involved in activation of G6PD. Future studies will be design to further characterize: - The role of protease inhibitors and red cell homeostasis since anemia is a major limitation of this therapeutic approach. - The role of Fyn in G6PD/NADP/Thioredoxin reductase pathway towards Prx2 in both mouse and human red cells.
2015
red cells; cell signalling; internal medicine
I globuli rossi sono cellule anucleate altamente specializzate nel trasporto dell’ossigeno e dell’anidride carbonica. La membrana plasmatica che li circonda svolge un ruolo essenziale per il corretto svolgimento della loro funzione ed è costituita da un doppio strato di fosfolipidi e colesterolo all’interno del quale sono immerse numerose proteine integrali di membrana, tra cui la banda 3 risulta essere la più abbondante. La banda 3, oltre a consentire lo scambio di ioni cloro con ioni bicarbonato attraverso la membrana, riveste un ruolo fondamentale nella connessione con il network di proteine citoscheletriche (come le alfa-beta spettrine) attraverso l’interazione con il complesso multiproteico dell’anchirina e il complesso multiproteico della banda 4.1. Tali interazioni conferiscono agli eritrociti caratteristiche univoche di plasticità e stabilità meccanica che ne garantiscono la permanenza all’interno della circolazione periferica. In questo contesto le modificazioni post-traslazionali delle proteine, in risposta a molteplici stimoli cellulari, modulano rapidamente la loro funzione ed il loro stato conformazionale. Tra queste, la fosforilazione dei residui di tirosina (Tyr) o serina/treonina (Ser/Thr), finemente regolata da specifiche chinasi e fosfatasi, risulta essere cruciale in svariati processi cellulari, come ad esempio il controllo del volume cellulare, la stabilità meccanica della membrana o il trasporto di ioni attraverso di essa. Lo scopo del presente progetto di ricerca è stato quello di analizzare i sistemi di trasduzione del segnale coinvolti nell’omeostasi eritrocitaria, con particolare attenzione a due modelli di globuli rossi patologici. Nella prima parte della ricerca abbiamo valutato l’effetto della triplice terapia antivirale a base di interferone pegilato e ribavirina in combinazione con un inibitore di proteasi di prima generazione (Telaprevir o Boceprevir) sugli eritrociti di pazienti affetti da epatite C cronica. I risultati ottenuti dimostrano che la triplice terapia induce un’anemia sferocitica acquisita con un incremento della quota di beta adducina fosforilata. Ulteriori studi ci permetteranno di caratterizzare meglio il ruolo degli inibitori di proteasi sull’omeostasi cellulare, tenendo in considerazione che l’anemia è una delle maggiori limitazioni di questo approccio terapeutico. Nella seconda parte del progetto di ricerca abbiamo analizzato gli eritrociti di un modello murino transgenico knock out per Fyn, una chinasi della famiglia delle Src, che presentano le caratteristiche tipiche dei globuli rossi di pazienti con deficit di G6PD (glucosio 6-fosfato deidrogenasi). I nostri risultati dimostrano che Fyn è coinvolta nell’attivazione della G6PD e nel corretto funzionamento dei sistemi antiossidanti all’interno dei globuli rossi, in particolare nel pathway G6PD/NADP/Tioredossina reduttasi in relazione alla rigenerazione della perossiredossina 2 (Prx2) sia in eritrociti murini che umani.
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