Application of Nanostructures for Treatment and Diagnosis of Solid Tumors

Nell’era moderna, la tecnologia ha un impatto determinante sulla vita di tutti i giorni. Ci aiuta ad adattarci all’ambiente naturale, a svolgere compiti specifici e complessi, a risolvere problemi, e migliora la qualità della nostra vita. L’emergere della nanotecnologia, cioè la comprensione ed il controllo della materia a dimensioni del nanometro, sta ulteriormente rivoluzionando le applicazioni tecnologiche, poiché le dimensioni così ridotte conferiscono nuove proprietà che sono differenti da quelle del materiale di grande volume. Tra i diversi campi di applicazione delle nanotecnologie, la nanomedicina è rivestita di grande interesse per le sue implicazioni nell’assistenza sanitaria e specialmente nel trattamento del cancro. Infatti, un farmaco antitumorale deve fronteggiare diversi ostacoli per raggiungere il suo sito di azione, principalmente a causa del sistema immunitario dell’organismo, dell’anomalo afflusso vascolare ai tessuti cancerosi, del microambiente tumorale ostile e dei meccanismi intracellulari per la sua internalizzazione. Alcuni dei problemi appena menzionati limitano anche l’accumulo dei traccianti impiegati per le procedure di imaging diagnostico. L’utilizzo di nanostrutture per trasportare farmaci e/o traccianti al sito del tumore offre diversi vantaggi, dal momento che le nanostrutture aumentano la stabilità, la farmacocinetica e la biodistribuzione della molecola di interesse, e la proteggono dall’ambiente biologico. Inoltre è possibile produrre diversi tipi di nanostrutture con differenti proprietà, offrendo la scelta di quale sia il migliore in base alle necessità dello specifico scopo medico. Le nanotecnologie possono anche migliorare la creazione di dispositivi o metodologie per sviluppare nuove analisi ex vivo a scopo diagnostico. Un nuovo strumento per il trattamento del cancro può derivare dalle cosiddette cellule tumorali circolanti (CTC), che sono cellule staccatesi dal tumore primario e che circolano nel flusso sanguigno. Queste cellule sono critiche nella progressione del tumore poiché la loro extravasazione in organi distanti può dare luogo all’insorgere di tumori secondari (ovvero, il processo di metastatizzazione). Il numero di CTC trovate nel sangue dei pazienti ha un significato prognostico nel cancro metastatico della mammella, della prostata e del colon retto, ma possono essere trovate anche in altri tipi di tumori. Inoltre, cambiamenti nei conteggi di CTC durante il trattamento possono predire la sopravvivenza al tumore, evidenziando il potenziale utilizzo delle CTC come un biomarcatore tumorale nel nuovo concetto di “biopsia liquida”. La sfida principale nell’analisi delle CTC risiede nel loro numero estremamente ridotto anche in pazienti con malattia metastatica, e nel loro fenotipo eterogeneo dal momento che possono assumere un fenotipo più epiteliale o più mesenchimale a seconda dello stadio di sviluppo metastatico. Stanno emergendo diverse piattaforme per l’isolamento e l’identificazione delle CTC, e prima di tutto per la loro conta, alcune delle quali sfruttano le proprietà biologiche (es. marcatori tumorali specifici) e altre le proprietà fisiche (come dimensione e proprietà dielettriche), e le nanotecnologie possono offrire un aiuto significativo in questa sfida. Lo scopo di questo lavoro è creare, valutare ed implementare nuove strategie diagnostiche per il trattamento del cancro con l’applicazione di nanotecnologie innovative, che potrebbero poi offrire la possibilità di convertire le nanostrutture sviluppate per la diagnosi in approcci terapeutici per il trattamento della malattia. Diverse tipologie di nanosistemi sono state sviluppate durante questo progetto di dottorato allo scopo di affrontare alcune limitazioni delle attuali metodologie diagnostiche in vivo ed ex vivo applicate nel trattamento del cancro. In particolare, abbiamo sintetizzato e valutato una nuova classe di nanostrutture, ovvero nanoparticelle multifunzionali composte da una lega di oro e ferro. Il vantaggio di queste nanoparticelle è che offrono una buona performance nell’imaging a risonanza magnetica (MRI), nella tomografia computerizzata (CT) e nella spettroscopia Raman amplificata da superfici (SERS) allo stesso tempo, per ottenere sia informazioni anatomiche e fisiologiche (MRI e CT) che un’elevata risoluzione spaziale per l’imaging intraoperatorio (SERS). Le loro caratteristiche di compatibilità biologica e utilizzabilità sono state confermate sia in vitro che in vivo, dove le nostre nanoparticelle mostrano anche la capacità di accumularsi nelle lesioni cancerose grazie all’effetto di aumentata permeabilità e ritenzione al sito tumorale (effetto EPR). Abbiamo anche investigato una nuova intrigante strategia di targeting tumorale utilizzando cellule di macrofago come trasportatori, poiché i macrofagi migrano ai siti di infiammazione come i microambienti tumorali. Abbiamo sviluppato nanosistemi che possiedono sia proprietà superparamagnetiche che attività Raman attraverso un’opportuna mescolanza di nanoparticelle di oro e di ossido di ferro in un singolo strumento. Utilizzando queste nanostrutture, siamo in grado di caricare cellule macrofagiche e poi separare questa popolazione di interesse da altre popolazioni cellulari, allo scopo di utilizzarla per una somministrazione in vivo in modelli tumorali singenici murini. Inoltre, abbiamo ulteriormente implementato questa tipologia di nanostrutture in una nuova architettura “core-shell-satellite” per essere in grado di legare anticorpi come molecole guida per un targeting tumorale attivo. Queste nuove nanoparticelle sono in grado di riconoscere una popolazione che esprime l’antigene e separarla dall’ambiente circostante grazie alle loro proprietà magnetiche. L’ultima parte di questo lavoro è dedicata all’isolamento, conteggio e analisi fenotipica delle CTC presenti nel sangue dei pazienti oncologici. Pensiamo che un’investigazione a livello molecolare degli antigeni espressi su queste cellule, oltre il loro semplice conteggio, possa essere cruciale per i clinici nel definire una diagnosi esauriente e per guidare anche le decisioni sul trattamento antitumorale. Allo scopo di superare le limitazioni dovute alla rarità delle CTC nel sangue dei pazienti, abbiamo sfruttato l’ultrasensibilità della spettroscopia Raman associata all’effetto SERS; quest’ultimo è in grado di aumentare il segnale del colorante Raman caricato sulle nanoparticelle plasmoniche, in modo da rilevare perfino intensità molto basse di segnale a livello della singola cellula. La metodologia Raman-SERS ci permette di studiare anche la possibilità di analisi multiparametriche, dove differenti marcatori cellulari possono essere studiati sulle stesse cellule allo stesso tempo e/o differenti popolazioni cellulari possono essere investigate per differenti marcatori fenotipici allo stesso tempo. Il nostro protocollo ottimizzato permette di catturare le CTC con un’efficienza >80% ed è possibile condurre l’analisi fenotipica tramite la spettroscopia Raman-SERS in un modo automatizzato grazie allo sviluppo di un adeguato strumento informatico. Il nostro approccio è stato validato preliminarmente utilizzando il nuovo chip per la cattura di CTC su campioni “combinati” (cellule mononucleate del sangue più cellule tumorali) che imitano i reali campioni CTC.

In the modern era, technology has a crucial impact on everyday life. It helps us to adapt to the natural environment, perform specific and complex tasks, solve problems, and improve the quality of our life. The arising of nanotechnology, that is the understanding and control of matter at dimensions on nanometre, is further revolutionising technological applications, since such reduced dimensions confer new properties that are different from those of the bulk material. Among several fields of application for nanotechnologies, nanomedicine is of great interest because of its implications in healthcare and especially in cancer management. Indeed, an antitumor drug has to face several hurdles in order to reach its site of action, mainly due to organism immune surveillance, abnormal vascular supply at cancerous tissues, hostile tumour microenvironment and intracellular pathways for its uptake. Some of these mentioned problems limit also the accumulation of tracers applied for diagnostic imaging procedures. The employment of nanostructures to deliver drugs and/or tracers at the tumor lesions offers several advantages as they improve stability, pharmacokinetics and biodistribution of the molecule of interest, and protect the drug from the biological environment. Moreover, it is possible to produce different types of nanostructures with different properties, offering the choice of what is better to use according to the needs of the specific medical purpose. Nanotechnology can also improve the creation of devices or methodologies to develop new ex vivo analysis with diagnostic purposes. A new tool in cancer management can be derived from the so-called circulating tumor cells (CTCs), which are cells detached from the primary tumor and circulating into the bloodstream. They are critical in tumor progression since their extravasation in distant organs can give rise to establishment of secondary tumors (i.e., metastatization process). The number of CTCs detected in the blood of patients has a prognostic value in metastatic breast, prostate and colorectal cancer, but they can be found also in other tumor types. Furthermore, changes in CTC counts during treatment can predict survival outcomes, highlighting the potential use of CTCs as a cancer biomarker in the new concept of “liquid biopsy”. The main challenge of CTC analysis relays in their extremely low number also in patients with metastatic disease, and their heterogeneous phenotype as they can have a more epithelial-like or mesenchymal-like phenotype according to the stage of metastatic development. Several platforms are emerging for CTCs isolation and detection, first of all for their enumeration, some exploiting their biological properties (i.e., tumor specific markers) and others their physical properties (i.e., size and dielectric properties), and nanotechnologies can offer a significant help with this challenge. The aim of this work is to create, evaluate and implement new diagnostic strategies for cancer management with the application of innovative nanotechnologies, which could offer also the possibility to translate the developed diagnostic nanostructures into therapeutic approaches for the disease treatment. Multiple types of nanosystems have been developed during this PhD project in order to approach some limitations of the current in vivo and ex vivo diagnostic methodologies applied into cancer management. In particular, we have synthesized and assessed a new class of nanostructures, the multifunctional Au-Fe alloy nanoparticles. The goal of these nanoparticles is that they offer a good performance in magnetic resonance imaging (MRI), computed X-ray tomography (CT) and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) at the same time, to obtain both anatomical and physiological information (MRI and CT) and high spatial resolution for intrasurgical imaging (SERS). Their features of biological compatibility and exploitability have been confirmed both in vitro and in vivo, where our nanoparticles show also the capability to accumulate at cancerous lesions by enhanced permeability and retention (EPR) effect. We have also investigated a new intriguing strategy to target tumors by means of macrophage cells as carriers, since macrophages migrate at inflammatory sites as tumor microenvironments. We have developed nanosystems that own both superparamagnetic properties and Raman activity by an appropriate mixing of gold and iron oxide nanoparticles in one single tool. By using these nanostructures, we are able to load macrophage cells and then separate this population of interest from other cell populations, in order to exploit it for in vivo administration in syngeneic mouse tumor models. Moreover, we have further implemented this typology of nanostructures in a new core-shell-satellite architecture to be able to link antibodies as driving moieties for an active tumor targeting. These new nanoparticles are able to recognize and separate the antigen expressing population from surrounding environment thanks to their magnetic properties. The last part of this work is dedicated to the isolation, enumeration and phenotypic analysis of the CTCs present in the blood of oncologic patients. We think that a molecular investigation of antigens expressed on these cells can be crucial for clinicians to define a comprehensive diagnosis and even to guide treatment decision, beyond their simple enumeration. In order to overcome the limitations due to the rarity of CTCs in patient blood, we have exploited the ultra-sensitivity of Raman spectroscopy associated to SERS effect; this is able to increase the signal of Raman dyes loaded on plasmonic nanoparticles, in order to detect even very low signal intensities at the single cell level. The Raman-SERS methodology allow us to study also the possibility of multiplexing analysis, where different cellular markers can be studied on the same cells at the same time and/or different cell populations can be investigated for different phenotype markers at the same time. Our optimized protocol allow to trap CTCs with an efficiency >80% and the phenotype analysis by Raman-SERS spectroscopy in an automatized way is possible thanks to the development of an appropriate computer tool. Our approach has been preliminary validated by applying the new chip for CTC capture with spiked samples (blood mononuclear cells plus tumor cells) that mimic the real CTC samples.