Characterization of anti-angiogenic properties of miniproteins isolated from tomato

L’angiogenesi, ossia la formazione di nuovi vasi sanguini, è un evento cruciale nella crescita tumorale e nell’infiammazione. La scoperta degli inibitori dell’angiogenesi si è rivelata una efficace strategia terapeutica. L’effetto preventivo verso le malattie da parte di alcuni componenti presenti nella dieta ha ricevuto una crescente attenzione negli ultimi anni. Il pomodoro è ricco in composti ad attività antiangiogenica, come il licopene e le miniproteine a nodo di cistina (TCMPs). Le TCMPs appartengono ad una vasta famiglia di proteine ricche di cisteine presenti in molti organismi, e caratterizzate da tre legami intramolecolari formanti un motivo strutturale chiamato a nodo di cistine. Queste proteine posseggono un largo spettro di attività terapeutiche. In un precedente studio, Cavallini et al. (2011) identificarono in pomodoro due tipi di miniproteine a nodo di cistine, TCMP-1 e TCMP-2 e ne definirono le loro proprietà antiangiogeniche in vitro. Il lavoro sviluppato in questa tesi ha avuto come obiettivo quello di caratterizzare ulteriormente le TCMPs e di esplorare il meccanismo molecolare della loro attività antiangiogenica. Inizialmente è stato messo a punto un metodo di estrazione e purificazione delle TCMPs sia da frutto che da conserva di pomodoro. In seguito, mediante un modello in vitro di digestione simulata si è confermata la resistenza della TCMP-2 agli enzimi digestivi. Considerando le proprietà nutraceutiche delle TCMPs, è stato analizzato il contenuto di TCMP-2 in alcune varietà di pomodoro da consumo fresco e da industria. I risultati ottenuti mostravano variazioni nei livelli di TCMP-2 particolarmente nelle varietà da consumo fresco. Per caratterizzare l’attività biologica delle TCMPs è stato effettuata un’analisi qRT-PCR, per valutare l’espressione di geni coinvolti nel processo angiogenico, comparando cellule endoteliali di ombelico umano (HUVEC) trattate con la TCMP-2 e cellule non trattate. Uno dei principali effetti osservati è stato l’induzione del fattore di crescita vascolare (VEGF-A), la cui espressione era doppia nelle cellule trattate con TCMP-2, rispetto alle cellule non trattate. Il VEGF è un potente stimolo per l’angiogenesi e regola tutte le fasi del processo incluse la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali. Per valutare il potenziale effetto delle TCMPs nei confronti del recettore del VEGF-A è stata effettuata un’analisi western blot su cellule endoteliali di arteria suina (PAEC). Tale analisi ha evidenziato una parziale inibizione dello stato di fosforilazione del VEGFR indotto dal VEGF-A, a seguito del trattamento con 200 nM di TCMP-2. Basandoci su questi risultati, abbiamo indagato gli effetti determinati dalla TCMP-2 sulla migrazione cellulare e sulla produzione di ossido nitrico (NO), in cellule trattate con VEGF-A. I nostri dati mostrano che la TCMP-2 inibisce approssimativamente del 50% l’incremento nel numero delle cellule migrate indotto dal VEGF e diminuisce significativamente la produzione di NO. Al contrario il licopene mostrava di innalzare i livelli di NO nelle HUVEC stimolate con VEGF-A. Infine è stata osservata in vivo l’attività antiangiogenica delle TCMPs, utilizzando lo zebrafish come modello animale di angiogenesi. In questo modello, lo sviluppo vascolare procede gradualmente e allo stadio di 72-76 ore dopo la fertilizzazione (hpf), l’apparato vascolare è completamente funzionante. A questo stadio sono presenti i vasi subintestinali (SIVs) che sono stati utilizzati per esaminare gli effetti delle TCMPs. E’ stata osservata a 76 hpf una significativa inibizione dello sviluppo dei SIVs a 500 nM TCMP-2 dimostrando che le TCMPs potrebbero avere un effetto antiangiogenico in vivo. In conclusione i risultati di questa tesi contribuiscono ad aumentare le conoscenze sulle proprietà benefiche del pomodoro, considerato un alimento chiave della dieta Mediterranea. Ulteriori studi dovranno essere condotti al fine di valutare il potenziale terapeutico delle proteine a nodo di cistine presenti nel frutto del pomodoro.

Angiogenesis, the formation of new blood vessels, is critical to tumour growth and inflammation. The discovery of angiogenesis inhibitors disclosed effective therapeutic strategies. Dietary food compounds have received increasingly attention in disease prevention. The fruit of tomato is rich in compounds with potential anti-angiogenic activity such as lycopene and cystine-knot miniproteins (TCMPs). TCMPs belong to a large family of cysteine-rich proteins present in many organisms and characterized by three intramolecular disulfide bonds forming a structural motif called cystine-knot. These proteins have been characterised for a broad spectrum of therapeutical activities. In a previous study Cavallini et al. (2011) identified two tomato cystine-knot miniproteins (TCMP-1 and -2) and described their antiangiogenic properties in vitro. The present thesis aims to further characterize and give a mechanistic insight into the anti-angiogenic activity of the TCMP-2 which is most abundant in mature tomato fruit and in tomato products. We first set up a method for the extraction and purification of TMCPs from fruits and processed tomato products. The purified TCMP-2 proved to be resistant to gastric peptidases in simulated in vitro digestion. Fruits from several tomato varieties were analyzed for their TCMPs content, observing variations in TCMPs levels particularly in fresh-market varieties. Regarding the characterization of the biological activity of TCMPs, we performed a qRT-PCR expression analysis of genes involved in angiogenesis comparing TCMP-2-treated and untreated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We found that one of the main effects was the up-regulation of vascular endothelial growth factor (VEGF-A) gene, whose expression was doubled in TCMP-2-treated compared to untreated cells. VEGF is a potent angiogenic agent that regulates all the key steps of the angiogenic process, including endothelial cell proliferation and migration. In order to evaluate the potential effect of TCMPs on the phosphorylation state of VEGFR-2, we performed a western blot analysis on porcine artery endothelial cell (PAEC). This analysis provided evidence that 200 nM TCMP-2 partially inhibits the VEGFA-induced phosphorylation of VEGFR-2. Based on this evidence, we investigated the effects of TCMP-2 on cell migration and nitric oxide (NO) production in VEGF-induced endothelial cells. We found that TCMP-2 inhibits by approximately 50% the increase in cell migration induced by VEGF-A and significantly decreases the formation of NO. On the contrary, lycopene increased NO production in VEGF-A-treated HUVECs. Finally we explored the in vivo antiangiogenic potential of TCMPs using zebrafish embryos as an animal model of angiogenesis. Considering that during zebrafish development, at the stage 72-76 hour post-fertilization (hpf), a functioning vasculature, including subintestinal vessels (SIVs) has already formed, this time-frame was used to examine the TCMPs effects on vessels formation. We observed a significant inhibition of SIVs at 500 nM TCMPs after 76 hpf. These preliminary results suggest that TCMPs might exert antiangiogenic activity in vivo. The results of this thesis contribute to improving the knowledge of the beneficial effect of the tomato, a key component of the Mediterranean diet, in the prevention of diseases. Further investigations are required to evaluate the potential therapeutic implication of our findings.