Le Lipid Transfer Proteins (LTPs) sono piccole proteine basiche che costituiscono un’ampia famiglia e sono caratterizzate dall’abilità di trasferire fosfolipidi tra una membrana donatore e una accettore. In pianta le LTPs possono ricoprire diverse funzioni e alcune di esse svolgono un ruolo fondamentale nella simbiosi tra i rizobi e le leguminose. Il gene MtN5, codificante per una non specific-LTP di Medicago truncatula, viene attivato nelle fasi iniziali del processo simbiotico a livello dell’epidermide e dei peli radicali e regola positivamente il processo di nodulazione (Pii et al. 2009, Pii et al., 2012). Sulla base dell’omologia di sequenza con MtN5 sono state identificate altre due putative LTPs (Medtr3g055250 and Medtr7g052640) (Pii et al., 2013) in M. truncatula e l’obiettivo di questo assegno di ricerca è stato quello di comprendere se anche questi geni fossero coinvolti nei meccanismi molecolari di regolazione della simbiosi tra M. truncatula e Sinorhizobium meliloti. Il primo obiettivo è stato quello di studiare l’espressione dei geni in questione durante le varie fasi della simbiosi utilizzando la tecnica di RT-PCR quantitativa. A 72 ore dall’inoculo di M. truncatula con S. meliloti non si sono riscontrate variazioni significative nei livelli di espressione dei due geni nelle piante inoculate rispetto a quelle di controllo non inoculate. Tuttavia nelle piante che avevano sviluppato i primordi dei noduli (a 6 giorni dall’infezione) e i noduli maturi (18 giorni dopo infezione) l’espressione di entrambi i geni, Medtr3g055250 e Medtr7g052640, era aumentata rispetto ai livelli di trascritto riscontrati in piante non inoculate. La sovra-regolazione è stata particolarmente evidente per il Medtr7g052640, dove l’aumento di trascritto è stato rispettivamente di 9 e 21 volte rispettivamente in piante a 6 e 18 giorni dall’avvenuta infezione. Questi dati indicano che l’induzione del gene Medtr7g052640 avviene dopo l’invasione della radice da parte dei rizobi e suggeriscono che questa LTP potrebbe essere coinvolta nel targeting di nuovo materiale lipidico durante lo sviluppo del simbiosoma che richiede la riorganizzazione e la formazione de novo di membrane. Per quanto riguarda il gene Medtr3g055250 si è riscontrata una tendenza all’ aumento del livello di trascritto dopo inoculazione con ri zobi, tuttavia è necessario approfondire l’analisi per confermare la risposta di questo gene durante le diverse fasi dell’interazione simbiotica.. Al fine di investigare l’espressione temporale e spaziale di Medtr3g055250 e Medtr7g052640 a livello tissutale è stata monitorata l’attività dei due promotori tramite la fusione degli stessi con il gene reporter β-glucuronidase (GUS). I due costrutti sono stati inseriti in pianta tramite l’ausilio di Agrobacterium rhizogenes che permette di ottenere in tempi rapidi delle piante chimeriche aventi radici contenenti il transgene. Le radici transgeniche contenenti il costrutto PromMedtr7g052640::GUS così come quelle contenenti il costrutto PromMedtr3g055250::GUS non inoculate hanno mostrato l’attività del reporter nei siti di emergenza delle radici laterali e lungo tutta la lunghezza delle giovani radici laterali. D’altra parte le radici inoculate hanno mostrato un’induzione del gene GUS ben localizzata in conseguenza dell’inoculo delle piante con S. meliloti. In entrambi i casi, sei giorni dopo l’infezione, l’attività GUS è stata rilevata nei primordi dei noduli e, a 18 giorni dopo l’infezione, in tutti i tessuti dei noduli maturi e in modo predominante nella zona distale dei noduli. L’analisi ci ha quindi permesso di confermare la sovra-regolazione dei due geni nelle fasi tardive dell’infezione e ipotizzare che i prodotti genici possano avere una specifica funzione nel processo di nodulazione. L’instaurarsi della simbiosi è preceduto da un raffinato scambio di segnali biochimici tra la pianta e il microrganismo che coinvolge anche lipochitooligosaccaridi (LCO), composti prodotti sia da batteri azoto-fissatori che da funghi micorrizici arbuscolari che sono in grado di attivare la simbiosi. È stato quindi valutato se le LTPs in esame fossero coinvolte anche nella simbiosi tra M. truncatula e Glomus irregularis, fungo modello per lo studio di questo tipo di relazione simbiotica. A tal scopo è stata effettuata un’analisi di RT-PCR quantitativa su radici colonizzate dal fungo per verificare l’eventuale variazione dell’espressione dei geni Medtr3g055250 e Medtr7g052640 in risposta all’infezione fungina. I livelli di trascritto di entrambi i geni non hanno mostrato alcun tipo di variazione rispetto a piante non micorrizate, suggerendo quindi che queste LTPs siano coinvolte in modo specifico nella simbiosi con i rizobi.

Lipid transfer proteins (LTPs) are small basic proteins that constitute a large family characterized by the ability to transfer phospholipids between a donor and an acceptor membrane and can have many different roles in vivo. Recently it has been demonstrated that MtN5, a non specific LTP (ns-LTP) classified as type III (Wang et al., 2012), is involved in the symbiotic interaction between legumes and rhizobia (Pii et al. 2009, Pii et al., 2012). MtN5 is a nod factor responsive gene expressed at a very early phase of rhizobial symbiosis in the epidermis and root hairs and later in primordia and nodules. There are evidences that MtN5 positively regulates the nodulation process. Interestingly, two other putative type III ns-LTPs (Medtr3g055250 and Medtr7g052640) have been identified in Medicago truncatula genome. The aim of this study is to shed light on the role of these ns-LTPs in the symbiotic interaction between M. truncatula and Sinorhizobium meliloti.

Meccanismi molecolari di regolazione della nodulazione in Medicago truncatula

SANTI, Chiara
2014

Abstract

Le Lipid Transfer Proteins (LTPs) sono piccole proteine basiche che costituiscono un’ampia famiglia e sono caratterizzate dall’abilità di trasferire fosfolipidi tra una membrana donatore e una accettore. In pianta le LTPs possono ricoprire diverse funzioni e alcune di esse svolgono un ruolo fondamentale nella simbiosi tra i rizobi e le leguminose. Il gene MtN5, codificante per una non specific-LTP di Medicago truncatula, viene attivato nelle fasi iniziali del processo simbiotico a livello dell’epidermide e dei peli radicali e regola positivamente il processo di nodulazione (Pii et al. 2009, Pii et al., 2012). Sulla base dell’omologia di sequenza con MtN5 sono state identificate altre due putative LTPs (Medtr3g055250 and Medtr7g052640) (Pii et al., 2013) in M. truncatula e l’obiettivo di questo assegno di ricerca è stato quello di comprendere se anche questi geni fossero coinvolti nei meccanismi molecolari di regolazione della simbiosi tra M. truncatula e Sinorhizobium meliloti. Il primo obiettivo è stato quello di studiare l’espressione dei geni in questione durante le varie fasi della simbiosi utilizzando la tecnica di RT-PCR quantitativa. A 72 ore dall’inoculo di M. truncatula con S. meliloti non si sono riscontrate variazioni significative nei livelli di espressione dei due geni nelle piante inoculate rispetto a quelle di controllo non inoculate. Tuttavia nelle piante che avevano sviluppato i primordi dei noduli (a 6 giorni dall’infezione) e i noduli maturi (18 giorni dopo infezione) l’espressione di entrambi i geni, Medtr3g055250 e Medtr7g052640, era aumentata rispetto ai livelli di trascritto riscontrati in piante non inoculate. La sovra-regolazione è stata particolarmente evidente per il Medtr7g052640, dove l’aumento di trascritto è stato rispettivamente di 9 e 21 volte rispettivamente in piante a 6 e 18 giorni dall’avvenuta infezione. Questi dati indicano che l’induzione del gene Medtr7g052640 avviene dopo l’invasione della radice da parte dei rizobi e suggeriscono che questa LTP potrebbe essere coinvolta nel targeting di nuovo materiale lipidico durante lo sviluppo del simbiosoma che richiede la riorganizzazione e la formazione de novo di membrane. Per quanto riguarda il gene Medtr3g055250 si è riscontrata una tendenza all’ aumento del livello di trascritto dopo inoculazione con ri zobi, tuttavia è necessario approfondire l’analisi per confermare la risposta di questo gene durante le diverse fasi dell’interazione simbiotica.. Al fine di investigare l’espressione temporale e spaziale di Medtr3g055250 e Medtr7g052640 a livello tissutale è stata monitorata l’attività dei due promotori tramite la fusione degli stessi con il gene reporter β-glucuronidase (GUS). I due costrutti sono stati inseriti in pianta tramite l’ausilio di Agrobacterium rhizogenes che permette di ottenere in tempi rapidi delle piante chimeriche aventi radici contenenti il transgene. Le radici transgeniche contenenti il costrutto PromMedtr7g052640::GUS così come quelle contenenti il costrutto PromMedtr3g055250::GUS non inoculate hanno mostrato l’attività del reporter nei siti di emergenza delle radici laterali e lungo tutta la lunghezza delle giovani radici laterali. D’altra parte le radici inoculate hanno mostrato un’induzione del gene GUS ben localizzata in conseguenza dell’inoculo delle piante con S. meliloti. In entrambi i casi, sei giorni dopo l’infezione, l’attività GUS è stata rilevata nei primordi dei noduli e, a 18 giorni dopo l’infezione, in tutti i tessuti dei noduli maturi e in modo predominante nella zona distale dei noduli. L’analisi ci ha quindi permesso di confermare la sovra-regolazione dei due geni nelle fasi tardive dell’infezione e ipotizzare che i prodotti genici possano avere una specifica funzione nel processo di nodulazione. L’instaurarsi della simbiosi è preceduto da un raffinato scambio di segnali biochimici tra la pianta e il microrganismo che coinvolge anche lipochitooligosaccaridi (LCO), composti prodotti sia da batteri azoto-fissatori che da funghi micorrizici arbuscolari che sono in grado di attivare la simbiosi. È stato quindi valutato se le LTPs in esame fossero coinvolte anche nella simbiosi tra M. truncatula e Glomus irregularis, fungo modello per lo studio di questo tipo di relazione simbiotica. A tal scopo è stata effettuata un’analisi di RT-PCR quantitativa su radici colonizzate dal fungo per verificare l’eventuale variazione dell’espressione dei geni Medtr3g055250 e Medtr7g052640 in risposta all’infezione fungina. I livelli di trascritto di entrambi i geni non hanno mostrato alcun tipo di variazione rispetto a piante non micorrizate, suggerendo quindi che queste LTPs siano coinvolte in modo specifico nella simbiosi con i rizobi.
Lipid transfer proteins (LTPs) are small basic proteins that constitute a large family characterized by the ability to transfer phospholipids between a donor and an acceptor membrane and can have many different roles in vivo. Recently it has been demonstrated that MtN5, a non specific LTP (ns-LTP) classified as type III (Wang et al., 2012), is involved in the symbiotic interaction between legumes and rhizobia (Pii et al. 2009, Pii et al., 2012). MtN5 is a nod factor responsive gene expressed at a very early phase of rhizobial symbiosis in the epidermis and root hairs and later in primordia and nodules. There are evidences that MtN5 positively regulates the nodulation process. Interestingly, two other putative type III ns-LTPs (Medtr3g055250 and Medtr7g052640) have been identified in Medicago truncatula genome. The aim of this study is to shed light on the role of these ns-LTPs in the symbiotic interaction between M. truncatula and Sinorhizobium meliloti.
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