Assessment of nitric oxide signaling functions during the plant hypersensitive disease resistance response

In pianta, ossido nitrico (NO) gioca un ruolo cruciale nel segnale di difesa in risposta all’ infezione causata da batteri patogeni. Il segnale NO può essere mediato dalle sue dirette interazioni con molecole target, per esempio tramite modificazioni post-traduzionali, ma questo è pensato per le cellule animali, il segnale NO può essere anche usato come secondo messaggero cGMP (guanosina 3’,5’-monofosfato ciclico) in particolare per regolare la difesa del gene d’espressione. Benché, il ruolo di NO sia stato dimostrato durante l’HR, è ancora molto discusso, probabilmente perché i metodi di misurazione non sono del tutto specifici. Allo stesso modo, la rivelazione di cGMP in piante fino adesso, è stata basata su metodi che spesso illustrano bassa sensibilità e velocità. In più, è dovuto alla mancanza d’ identificazione d’ enzimi responsabili al metabolismo di cGMP; fino ad ora, il suo ruolo è stato ricercato solo attraverso l’ uso di composti farmacologici che raramente aumentano la domanda alla specificità di risposta. In questo studio, abbiamo confermato che NO è prodotto specificamente durante l’incompatibile interazione di un metodo chemoluminescente e che NO comporta la produzione principale di nitrito come substrato e richiede NR come altra risorsa(e) ancora non identificata. Inoltre, i metodi basati sull’alta sensibilità e alta velocità della tecnologia AlphaSceen erano applicati con successo in pianta a dimostrare la localizzazione locale di NO e l’aumento distale del livello cGMP in risposta ai patogeni avirulenti. La caratterizzazione della pianta transgenica Arabidopsis thaliana espressa in guanilato ciclasi (GC) solubile di mammifero mostrava che queste piante accumulavano alti livelli costitutivi di cGMP paragonato alle piante WT e illustravano un’ espressione alterata di acido salicilico dipendente dalle difese geniche correlate con perdita stabile acquisita del sistema di resistenza, mentre mostrano una normale resistenza e una morte cellulare ipersensibile a livello locale. Infine, nelle linee GC, il percorso SA-dipendente sembra essere compromesso in favore delle risposte jasmonate-dipendenti , suggerendo a cGMP un ruolo da interruttore per la regolazione ormonale .

In plants, nitric oxide (NO) plays a crucial role in mediating defense signal in response to infection by bacterial pathogens. NO signal can be mediated by its direct interaction with target molecules, via post-translational modifications for instance, but it is believed that, like in animal cells, NO signal can also be relay by the second messenger cGMP (cyclic guanosine 3',5'-monophosphate) in particular to regulate defense gene expression. Despite the demonstration of its role during the HR, the detection of NO is still highly debated, mainly because its measurement methods are not fully specific. In the same way, cGMP detection in plants until now has been based on methods that often display a low sensitivity and a low throughput. In addition, due to the lack of identification of the enzymes responsible for cGMP metabolism, until now, the role of cGMP has been investigated only with the use of pharmacological compounds that sometimes raise the question about response specificity. In this study, we thus confirmed that NO is produced specifically during the incompatible interaction thanks to a chemiluminescence-based method and that NO production involves mainly nitrite as substrate and requires NR as well as other source(s) still unidentified. Moreover, a highly sensitive and with high throughput method based on AlphaScreen technology was successfully applied in plants to demonstrate the NO-dependent local and distal increase of cGMP level in response to avirulent pathogens. The characterization of transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing the mammalian soluble guanylate cyclase (GC) showed that these plants accumulate high constitutive levels of cGMP compared with WT plants and display an altered expression of salicylic acid-dependent defence genes correlated with the loss of systemic acquired resistance establishment, while they show a normal resistance and hypersensitive cell death at local level. Moreover, in GC lines, SA-dependent pathway seems to be compromised in favour of jasmonate-dependent responses, suggesting a role for cGMP in regulating the hormonal switch.