Il continuo affermarsi della resistenza agli agenti antibatterici da parte della popolazione microbica costituisce una preoccupazione pressante, in particolare per la salute umana. L’acquisizione della resistenza batterica ha portato diversi antibiotici alla loro inutilità o, nel migliore dei casi, alla compromissione nella capacità di contrastare le infezioni [Coates et al., 2002]. Il manifestarsi, dunque, di resistenza da parte degli agenti patogeni richiede la continua identificazione di nuovi farmaci. L’individuazione delle vie di biosintesi degli amminoacidi come potenziali bersagli antimicrobici è stata validata chimicamente e biochimicamente [Ejim et al., 2007]. A tal proposito, la metionina è un amminoacido chiave nei procarioti, per il suo importante coinvolgimento nel metabolismo cellulare, e rappresenta quindi un allettante bersaglio antimicrobico. In particolare, sotto forma di S-adenosilmetionina, essa svolge il ruolo di donatore metilico in svariate ed essenziali reazioni biochimiche. Oltre alla vitale importanza per la crescita microbica, alcuni passaggi che caratterizzano la via di biosintesi di tale aminoacido risultano essere unici per batteri e piante; la loro assenza nei mammiferi riduce quindi la probabilità di riscontrare effetti collaterali indesiderati. In questa tesi di dottorato, viene proposto lo studio di uno degli enzimi necessari per la biosintesi della metionina in Corynebacterium diphtheriae, batterio patogeno che provoca la difterite. La proteina di interesse reca codice NCBI NP_940074 ed è stata annotata come C-S liasi dipendente dal cofattore piridossal-5'-fosfato (PLP). Anche nei Paesi con buoni programmi di immunizzazione, mediante vaccinazione durante l’infanzia, la minaccia della difterite non è scomparsa; epidemie in molti Paesi europei hanno rivelato una diminuzione dell’immunità per questa malattia, in particolare, tra gli adulti [Gałazka, 2000]. La cura di pazienti affetti da difterite si basa attualmente sulla somministrazione di antibiotici per eliminare il batterio dal sito dell’infezione, al fine di interrompere la produzione della tossina, con o senza ulteriore trattamento con immunoglobuline specifiche [Wagner et al., 2009]. L'antitossina difterica (DAT) contribuisce a ridurre il tasso di mortalità in relazione alle infezioni causate dal microrganismo, ma è improbabile che, nel prossimo futuro, il consumo mondiale di agenti antimicrobici si riduca in modo sensibile. Ciò sottolinea l'importanza dello sviluppo di nuovi farmaci antibatterici. L’enzima C-S liasi catalizza la reazione di α,β-eliminazione di aminoacidi contenenti zolfo, quali L-cistationina (L-Cth), per generare ammoniaca, piruvato e omocisteina, ed è coinvolto nel penultimo passaggio della via di transulfurazione della metionina. La struttura della C-S liasi da C. diphtheriae è stata determinata mediante cristallografia a raggi X a 1.99 Å di risoluzione (codice PDB: 3FDB, Joint Center for Structural Genomics, http://www.jcsg.org/). In relazione al suo ripiegamento, l'enzima fa capo al cosiddetto fold-type I degli enzimi PLP-dipendenti [Schneider et al., 2000]. I membri di tale famiglia presentano un residuo aromatico in corrispondenza della faccia re dell’aldimina interna e in posizione di stacking rispetto all’anello piridinico del PLP. La struttura mostra che il sito di legame per il PLP, legato in modo covalente al residuo Lys222, è conservato; inoltre, il cofattore ha un'interazione stacking con Tyr114 e legami idrogeno con Asn160, Asp188 e His191. In ciascuna unità asimmetrica è presente una molecola (codice PDB:3FDB). Sebbene la struttura sia stata risolta, nessuna caratterizzazione dell’enzima era stata precedentemente riportata. In questo studio, C-S liasi è stata over-espressa nell’ospite Escherichia coli e l’ottenimento della proteina pura ha permesso di acquisire conoscenza delle proprietà biochimiche dell'enzima, mediante la caratterizzazione completa a livello cinetico e spettroscopico. A tal proposito sono stati presi in considerazione ed analizzati la specificità di substrato, la pH dipendenza dei parametri cinetici allo stato stazionario e le transizioni spettroscopiche della proteina indotte dalla presenza di ligandi [Astegno et al., 2013]. Il confronto delle strutture di C-S liasi da C. diphtheriae e di cistalisina da Treponema denticola ha mostrato caratteristiche simili a livello di ripiegamento. La mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per mettere in evidenza l'importanza di tre residui presenti nel sito attivo, Tyr55, Tyr114 e Arg351, andando ad analizzare gli effetti della sostituzione aminoacidica sulle proprietà catalitiche dell’enzima. Una migliore comprensione, ottenuta mediante questo lavoro di tesi, del sito attivo della proteina C-S liasi da C. diphtheriae e di ciò che determina la sua specificità di substrato e di reazione agevoleranno la progettazione di nuovi inibitori.

The emergence of resistance to antibacterial agents is a pressing concern for human health. New drugs to combat this problem are therefore in great demand. Acquired bacterial resistance has caused several antibiotics to become useless or, at best, compromised in their ability to counteract bacterial infection [Coates et al., 2002]. The manifestation of antibiotic resistance in microbial pathogens requires the identification of new antibacterial drugs. The potential of amino acid biosynthesis as an antimicrobial target has been validated both chemically and biochemically [Ejim et al., 2007]. Methionine represents a key amino acid in prokaryotes and it is an attractive antimicrobial target because of its important role in cell metabolism. Methionine, in the form of S-adenosylmethionine, is the methyl donor for a number of essential biochemical reactions. The biosynthesis of methionine is therefore of vital importance to microbial growth and it is therefore an attractive target. Moreover, most of the steps in the methionine biosynthesis pathway are unique to bacteria and plants; their absence in mammals reduces the probability of unwanted side effects. We have studied one of the enzymes required for methionine biosynthesis, namely, NCBI protein NP_940074, which has been annotated as a pyridoxal-5'-phosphate (PLP-)dependent C-S lyase from Corynebacterium diphtheriae, a pathogenic bacterium that causes diphtheria. The threat of diphtheria, even in countries with good coverage in childhood immunization programs by vaccination, has not disappeared and outbreaks in many European countries have revealed a phenomenon of decreasing immunity to diphtheria among adults [Galazka, 2000]. The treatment of diphtheria patients is based on administration of antibiotics to eliminate the corynebacteria from the site of infection, thus stopping ongoing toxin production with or without additional treatment with specific immunoglobulins [Wagner et al., 2009]. Thus, while diphtheria antitoxin (DAT) contributes to reducing the case fatality rates of infections due to this microorganism, it is unlikely, in the foreseeable future, that it will substantially reduce the world’s consumption of antimicrobial agents. This highlights the importance of the development of new antibacterial drugs. C-S lyase catalyzes the ,-elimination of sulfur-containing amino acids, such as L-cystathionine (L-Cth), to generate ammonia, pyruvate, and homocysteine, the penultimate step in methionine biosynthesis transsulfuration pathway. The crystal structure of C. diphtheriae C-S lyase has been determined by X-ray crystallography at 1.99 Å resolution (PDB code: 3FDB, Joint Center for Structural Genomics, http://www.jcsg.org/). According to its folding pattern, the enzyme belongs to the fold type I family of the PLP-dependent enzymes [Schneider et al., 2000]. The commonly known fold type I PLP-dependent enzymes have an aromatic amino acid residue located at the re face of the PLP-Lys internal aldimine and stacking with the pyridine ring of PLP. The structure shows that a conserved binding site for PLP which is covalently linked to Lys222 has a stacking interaction with Tyr114 and H-bond interaction with Asn160, Asp188, and His191. There is one molecule in each asymmetric unit (PDB code: 3FDB). Although the crystal structure has been solved, no protein characterization and structure-based design studies have been reported to date. We overexpressed the protein in E. coli and the availability of the protein in purified form has allowed us to obtain an insight into the biochemical properties of the enzyme by thorough characterization of its kinetic and spectral properties. Substrate specificity, pH dependence of steady state kinetic parameters, and ligand-induced spectral transitions of the protein have been analyzed [Astegno et al., 2013]. Structural comparison of the enzyme with cystalysin from Treponema denticola indicates a similarity in overall folding. We used site-directed mutagenesis to highlight the importance of active site residues Tyr55, Tyr114, and Arg351, analyzing the effects of amino acid replacement on catalytic properties of enzyme. Better understanding of the active site of C. diphtheriae C-S lyase and the determinants of substrate and reaction specificity from this work will facilitate the design of novel inhibitors as antibacterial therapeutics.

Exploration of the Active Site of Corynebacterium diphtheriae C-S Lyase, a Possible Target for New Antimicrobial Drug

Allegrini, Alessandra
2014

Abstract

Il continuo affermarsi della resistenza agli agenti antibatterici da parte della popolazione microbica costituisce una preoccupazione pressante, in particolare per la salute umana. L’acquisizione della resistenza batterica ha portato diversi antibiotici alla loro inutilità o, nel migliore dei casi, alla compromissione nella capacità di contrastare le infezioni [Coates et al., 2002]. Il manifestarsi, dunque, di resistenza da parte degli agenti patogeni richiede la continua identificazione di nuovi farmaci. L’individuazione delle vie di biosintesi degli amminoacidi come potenziali bersagli antimicrobici è stata validata chimicamente e biochimicamente [Ejim et al., 2007]. A tal proposito, la metionina è un amminoacido chiave nei procarioti, per il suo importante coinvolgimento nel metabolismo cellulare, e rappresenta quindi un allettante bersaglio antimicrobico. In particolare, sotto forma di S-adenosilmetionina, essa svolge il ruolo di donatore metilico in svariate ed essenziali reazioni biochimiche. Oltre alla vitale importanza per la crescita microbica, alcuni passaggi che caratterizzano la via di biosintesi di tale aminoacido risultano essere unici per batteri e piante; la loro assenza nei mammiferi riduce quindi la probabilità di riscontrare effetti collaterali indesiderati. In questa tesi di dottorato, viene proposto lo studio di uno degli enzimi necessari per la biosintesi della metionina in Corynebacterium diphtheriae, batterio patogeno che provoca la difterite. La proteina di interesse reca codice NCBI NP_940074 ed è stata annotata come C-S liasi dipendente dal cofattore piridossal-5'-fosfato (PLP). Anche nei Paesi con buoni programmi di immunizzazione, mediante vaccinazione durante l’infanzia, la minaccia della difterite non è scomparsa; epidemie in molti Paesi europei hanno rivelato una diminuzione dell’immunità per questa malattia, in particolare, tra gli adulti [Gałazka, 2000]. La cura di pazienti affetti da difterite si basa attualmente sulla somministrazione di antibiotici per eliminare il batterio dal sito dell’infezione, al fine di interrompere la produzione della tossina, con o senza ulteriore trattamento con immunoglobuline specifiche [Wagner et al., 2009]. L'antitossina difterica (DAT) contribuisce a ridurre il tasso di mortalità in relazione alle infezioni causate dal microrganismo, ma è improbabile che, nel prossimo futuro, il consumo mondiale di agenti antimicrobici si riduca in modo sensibile. Ciò sottolinea l'importanza dello sviluppo di nuovi farmaci antibatterici. L’enzima C-S liasi catalizza la reazione di α,β-eliminazione di aminoacidi contenenti zolfo, quali L-cistationina (L-Cth), per generare ammoniaca, piruvato e omocisteina, ed è coinvolto nel penultimo passaggio della via di transulfurazione della metionina. La struttura della C-S liasi da C. diphtheriae è stata determinata mediante cristallografia a raggi X a 1.99 Å di risoluzione (codice PDB: 3FDB, Joint Center for Structural Genomics, http://www.jcsg.org/). In relazione al suo ripiegamento, l'enzima fa capo al cosiddetto fold-type I degli enzimi PLP-dipendenti [Schneider et al., 2000]. I membri di tale famiglia presentano un residuo aromatico in corrispondenza della faccia re dell’aldimina interna e in posizione di stacking rispetto all’anello piridinico del PLP. La struttura mostra che il sito di legame per il PLP, legato in modo covalente al residuo Lys222, è conservato; inoltre, il cofattore ha un'interazione stacking con Tyr114 e legami idrogeno con Asn160, Asp188 e His191. In ciascuna unità asimmetrica è presente una molecola (codice PDB:3FDB). Sebbene la struttura sia stata risolta, nessuna caratterizzazione dell’enzima era stata precedentemente riportata. In questo studio, C-S liasi è stata over-espressa nell’ospite Escherichia coli e l’ottenimento della proteina pura ha permesso di acquisire conoscenza delle proprietà biochimiche dell'enzima, mediante la caratterizzazione completa a livello cinetico e spettroscopico. A tal proposito sono stati presi in considerazione ed analizzati la specificità di substrato, la pH dipendenza dei parametri cinetici allo stato stazionario e le transizioni spettroscopiche della proteina indotte dalla presenza di ligandi [Astegno et al., 2013]. Il confronto delle strutture di C-S liasi da C. diphtheriae e di cistalisina da Treponema denticola ha mostrato caratteristiche simili a livello di ripiegamento. La mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per mettere in evidenza l'importanza di tre residui presenti nel sito attivo, Tyr55, Tyr114 e Arg351, andando ad analizzare gli effetti della sostituzione aminoacidica sulle proprietà catalitiche dell’enzima. Una migliore comprensione, ottenuta mediante questo lavoro di tesi, del sito attivo della proteina C-S liasi da C. diphtheriae e di ciò che determina la sua specificità di substrato e di reazione agevoleranno la progettazione di nuovi inibitori.
pyridoxal 5′phosphate; reaction intermediates; alfa; beta-elimination; catalytic mechanism; protein engineering
The emergence of resistance to antibacterial agents is a pressing concern for human health. New drugs to combat this problem are therefore in great demand. Acquired bacterial resistance has caused several antibiotics to become useless or, at best, compromised in their ability to counteract bacterial infection [Coates et al., 2002]. The manifestation of antibiotic resistance in microbial pathogens requires the identification of new antibacterial drugs. The potential of amino acid biosynthesis as an antimicrobial target has been validated both chemically and biochemically [Ejim et al., 2007]. Methionine represents a key amino acid in prokaryotes and it is an attractive antimicrobial target because of its important role in cell metabolism. Methionine, in the form of S-adenosylmethionine, is the methyl donor for a number of essential biochemical reactions. The biosynthesis of methionine is therefore of vital importance to microbial growth and it is therefore an attractive target. Moreover, most of the steps in the methionine biosynthesis pathway are unique to bacteria and plants; their absence in mammals reduces the probability of unwanted side effects. We have studied one of the enzymes required for methionine biosynthesis, namely, NCBI protein NP_940074, which has been annotated as a pyridoxal-5'-phosphate (PLP-)dependent C-S lyase from Corynebacterium diphtheriae, a pathogenic bacterium that causes diphtheria. The threat of diphtheria, even in countries with good coverage in childhood immunization programs by vaccination, has not disappeared and outbreaks in many European countries have revealed a phenomenon of decreasing immunity to diphtheria among adults [Galazka, 2000]. The treatment of diphtheria patients is based on administration of antibiotics to eliminate the corynebacteria from the site of infection, thus stopping ongoing toxin production with or without additional treatment with specific immunoglobulins [Wagner et al., 2009]. Thus, while diphtheria antitoxin (DAT) contributes to reducing the case fatality rates of infections due to this microorganism, it is unlikely, in the foreseeable future, that it will substantially reduce the world’s consumption of antimicrobial agents. This highlights the importance of the development of new antibacterial drugs. C-S lyase catalyzes the ,-elimination of sulfur-containing amino acids, such as L-cystathionine (L-Cth), to generate ammonia, pyruvate, and homocysteine, the penultimate step in methionine biosynthesis transsulfuration pathway. The crystal structure of C. diphtheriae C-S lyase has been determined by X-ray crystallography at 1.99 Å resolution (PDB code: 3FDB, Joint Center for Structural Genomics, http://www.jcsg.org/). According to its folding pattern, the enzyme belongs to the fold type I family of the PLP-dependent enzymes [Schneider et al., 2000]. The commonly known fold type I PLP-dependent enzymes have an aromatic amino acid residue located at the re face of the PLP-Lys internal aldimine and stacking with the pyridine ring of PLP. The structure shows that a conserved binding site for PLP which is covalently linked to Lys222 has a stacking interaction with Tyr114 and H-bond interaction with Asn160, Asp188, and His191. There is one molecule in each asymmetric unit (PDB code: 3FDB). Although the crystal structure has been solved, no protein characterization and structure-based design studies have been reported to date. We overexpressed the protein in E. coli and the availability of the protein in purified form has allowed us to obtain an insight into the biochemical properties of the enzyme by thorough characterization of its kinetic and spectral properties. Substrate specificity, pH dependence of steady state kinetic parameters, and ligand-induced spectral transitions of the protein have been analyzed [Astegno et al., 2013]. Structural comparison of the enzyme with cystalysin from Treponema denticola indicates a similarity in overall folding. We used site-directed mutagenesis to highlight the importance of active site residues Tyr55, Tyr114, and Arg351, analyzing the effects of amino acid replacement on catalytic properties of enzyme. Better understanding of the active site of C. diphtheriae C-S lyase and the determinants of substrate and reaction specificity from this work will facilitate the design of novel inhibitors as antibacterial therapeutics.
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