Cell-specific epigenetic landscapes drive differential cytokine expression in human neutrophils and monocytes

I neutrofili polimorfonucleati fungono da prima linea di difesa nella risposta immunitaria innata dell’ospite contro microorganismi patogeni. Inoltre, numerose ricerche condotte negli ultimi 20 anni hanno permesso di capire quanto i neutrofili siano cellule versatili, in grado di svolgere anche ruoli importanti nel collegamento tra la risposta immunitaria innata e quella adattativa. Quest’ultima funzione avviene in parte grazie alla capacità dei neutrofili di sintetizzare de novo e in seguito rilasciare una grande varietà di citochine. In letteratura non è presente un generale accordo sulla capacità da parte dei neutrofili di produrre le citochine IL-6 (ad azione sia pro- che anti-infiammatoria) e IL-10 (ad azione esclusivamente anti-infiammatoria), entrambe mediatori molto importanti per un funzionamento bilanciato del sistema immunitario. Di conseguenza l’obiettivo del nostro studio è stato quello di chiarire, per mezzo di analisi a livello della struttura della cromatina, se neutrofili umani isolati al massimo grado di purezza, esprimano o meno IL-6 in risposta a vari stimoli, inclusi agonisti dei recettori TLR. Come ulteriore obiettivo ci siamo inoltre proposti di verificare se l’incapacità dei neutrofili di produrre IL-10, come da noi precedentemente osservato, avesse possibili spiegazioni sempre a livello epigenetico. Una visione completa di come l’espressione di IL-6 e IL-10 sia regolata a livello molecolare in tipi cellulari specifici, ha ovvie implicazioni per una migliore comprensione della patogenesi di malattie infiammatorie, così come per eventuali strategie immunoterapiche. Tra i risultati ottenuti all'interno dell'attività di ricerca sviluppata durante il corso di dottorato, è stato osservato che neutrofili umani isolati al massimo livello di purezza sono in grado di produrre IL-6 in risposta ad agonisti del TLR8 e, in maniera meno efficiente, TLR4. E’ interessante notare che in neutrofili e monociti autologhi sono state riscontrate cinetiche di espressione e rilascio di IL-6 molto più ritardate nei neutrofili rispetto ai monociti. La spiegazione della ritardata espressione di IL-6 è stata individuata nella conformazione chiusa e inattiva della cromatina nel locus genomico di IL-6 in neutrofili non stimolati. In monociti autologhi invece il locus di IL-6 è risultato essere più pronto per un rapido rimodellamento della cromatina e quindi della trascrizione. Tale differenza è stata indicata dalla mancanza di diverse modificazioni degli istoni, tra le quali H3K4me1, H3K27Ac e H4Ac, sul locus di IL-6 nei neutrofili ma non nei monociti, come identificato mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Tuttavia, nei neutrofili, la cromatina sul locus di IL-6 viene riorganizzata in seguito a stimolazione con R848, come indicato dal reclutamento di PU.1, C/EBPβ, NF-κB e dall’acquisizione di livelli significativi di modificazioni degli istoni (H3K27Ac, H4Ac, H3K4me1 e H3K4me3) in enhancers indotti de novo o nel promotore. Nel presente studio di dottorato è stato inoltre osservato che l’espressione di IL-6 in neutrofili e monociti è regolata mediante l’uso da parte dei due tipi cellulari di diversi enhancers. Infatti, tra i vari enhancers indotti de novo, ne è stato individuato uno posizionato 14 kb a monte del sito d'inizio della trascrizione (TSS) peculiare per i neutrofili mentre un altro, posizionato 64 kb a monte del TSS, è invece risultato essere un sito regolatorio più specifico per i monociti. Inoltre, in neutrofili stimolati a tempi lunghi con R848, è stato osservato un ruolo di amplificazione dell’espressione di IL-6 da parte del TNFα endogeno, esercitato da questa citochina mediante la modificazione della cromatina nel locus di IL-6 e la prolungata induzione dell’espressione proteica di IkBz, portando quindi ad un aumentato legame di fattori di trascrizione nelle regioni genomiche regolatorie di IL-6. Come il locus di IL-6, anche il locus di IL-10 è stato confermato essere chiuso/inattivo in neutrofili non stimolati, come indicato mediante saggi di ChIP dalla mancanza delle modificazioni degli istoni H3K4me3, H3K27Ac, H4Ac nei neutrofili e contrariamente a quanto osservato nei monociti. Diversamente dal locus di IL-6 però il locus di IL-10 in neutrofili umani, isolati sia da donatori sani che da pazienti affetti da melanoma, è stato dimostrato mantenere un’organizzazione della cromatina inattiva anche in seguito a stimolazione con LPS, SAA o Pam3CSK4, come provato mediante ChIP dalla mancata induzione delle modificazioni degli istoni e dal reclutamento di fattori di trascrizione. Gli eventi sopracitati sono invece stati osservati sia in monociti autologhi che in neutrofili murini. Nel complesso, i risultati ottenuti all'interno dell'attività di ricerca sviluppata durante il corso di dottorato hanno permesso di chiarire le controversie presenti in letteratura a riguardo della capacità dei neutrofili umani di sintetizzare IL-6 e IL-10 e scoprire che, anche in queste cellule, l’espressione delle citochine può essere regolata in maniera sostanziale a livello epigenetico.

Polymorphonuclear neutrophils typically function at the frontline of innate defense in host responses to foreign microorganisms. In addition, extensive research performed in the last 20 years has contributed to recognize neutrophils as versatile cells, also displaying an important role in linking the innate and adaptive arms of the immune response. The latter function occurs, in part, by virtue of the capacity of neutrophils to de novo synthesize and release a vast repertoire of cytokines. There is not a general consensus in the literature as to whether human neutrophils produce pro- or anti-inflammatory IL-6 or anti-inflammatory IL-10, both cytokines being highly important for the balanced functioning of the immune system. Consequently, the objective of the study was to clarify, by studies at the level of chromatin structure, whether highly pure human neutrophils express IL-6 in response to various stimuli, including TLR agonists, and whether we could confirm, at chromatin level, our previous observation about neutrophils’ incapacity to produce IL-10. A complete understanding of how IL-6 and IL-10 expression is regulated at molecular level in specific cell types has obvious implications for a better comprehension of inflammatory disease pathogenesis, as well as for immunotherapeutic strategies. As a result of the doctoral study, it was observed that highly pure human neutrophils genuinely produce IL-6 in response to agonists for TLR8 and (less efficiently) TLR4. Interestingly, the kinetics of IL-6 expression and release differed between neutrophils and autologous monocytes, being both significantly delayed in neutrophils. The delayed expression of IL-6 was explained by closed/inactive conformation of chromatin in the entire IL-6 locus in resting neutrophils, while it appeared already poised for transcription and more prone for rapid chromatin remodeling in autologous monocytes, indicated by the lack of H3K4me1, H3K27Ac and H4Ac marks at the IL-6 locus in neutrophils while being readily present in monocytes, as discovered by chromatin immunoprecipitation (ChIP). Remarkably, IL-6 locus in neutrophils underwent chromatin reorganization upon R848-treatment, indicated by recruitment of PU.1, C/EBPβ, NF-κB and acquisition of significant levels of histone marks (H3K27Ac, H4Ac, H3K4me and H3K4me3) at de novo induced enhancers and at the promoter. Furthermore, in the current doctoral study it was discovered that IL-6 expression in neutrophils and monocytes was regulated by cell type-specific enhancer patterns. In fact, amongst others, de novo enhancer at 14kb upstream of transcription start site (TSS) was induced in neutrophils, but not in monocytes. Instead, an enhancer at 64kb upstream of TSS likely represented more prominent regulatory site in monocytes than in neutrophils. Furthermore, endogenous TNFα was found to amplify IL-6 expression at later time points in R848-treated neutrophils by modulating the chromatin landscape at the IL-6 locus and prolonging the induction of IκBζ antigenic expression, leading to enhanced transcription factor binding. The locus of IL-10, similarly to the locus of IL-6, was confirmed to be closed/inactive in resting neutrophils, indicated by the lack of H3K4me3, H3K27Ac, H4Ac marks at IL-10 locus, by ChIP, in neutrophils, contrary to monocytes. Interestingly, IL-10 locus, differently from IL-6 locus, retained inert chromatin organization even after upon LPS, SAA, or Pam3CSK4 stimulation, both in neutrophils from healthy donors and melanoma patients in contrary to autologous monocytes and murine neutrophils, indicated by the absence of induction of histone modifications and TF recruitment by ChIP. Altogether, the results of this doctoral study clarify controversial literature on the ability of human neutrophils to generate IL-6 and IL-10 and uncover that cytokine expression in these cells can be prominently regulated at epigenetic level.