Quality controls in Advanced Therapy Medicinal Products:safety assessment of Mesenchymal Stromal Cells to treat human bone defects

Negli ultimi 25 anni, c’è stato un crescente interesse nei confronti della medicina rigenerativa e questo ha portato allo sviluppo di una nuova categoria di prodotti medicinali basati sull’utilizzo di cellule, che vengono definiti come “Terapie Avanzate”. Il Regolamento N.1394/2007 del Parlamento Europeo, ha decretato l’esistenza di tre tipi di Prodotti Medicinali di Terapia Avanzata: “Prodotti di terapia genica”, “Prodotti di terapia cellulare somatica” e “Prodotti di ingegneria tissutale”. Lo scopo delle terapie cellulari è quello di prevenire o curare patologie attraverso l’effetto farmacologico, immunologico o metabolico esercitato dalle cellule. Le Cellule Stromali Mesenchimali (MSC) rappresentano i candidati ideali per questo tipo di terapie, per le seguenti motivazioni: sono cellule multipotenti facilmente estraibili da diversi tessuti; si espandono rapidamente in coltura e producono fattori trofici che modulano l’infiammazione, il rimodellamento tissutale e l’apoptosi; hanno proprietà immunomodulatorie. L’impiego di queste cellule in trial clinici richiede la dimostrazione della loro efficacia in esperimenti in vivo, e la loro produzione, come per ogni tipo di farmaco iniettabile, deve avvenire nel rispetto delle norme GMP (Norme di Buona Fabbricazione), le quali regolano i processi di produzione, la caratterizzazione dei prodotti finiti e i controlli di qualità. Tutte le fasi del processo di produzione delle MSC devono essere standardizzate per garantire una qualità e sicurezza cellulare riproducibili. Questo progetto è mirato a dimostrare la capacità di rigenerazione ossea delle cellule stromali mesenchimali ed ha come scopo primario la standardizzazione dei controlli di qualità necessari per la loro applicazione clinica. Partendo dai dati preclinici ottenuti in collaborazione con il gruppo di Burastero G., che aveva dimostrato in vivo la capacità delle MSC di favorire la rigenerazione ossea, abbiamo sviluppato un protocollo clinico di fase I che prevede il trattamento di difetti dell’osso scafoide con le MSC autologhe espanse ex-vivo in associazione ad Orthoss® (biomateriale inorganico di origine bovina) e BMP-7 (proteina osteoinduttiva ricombinante umana). La produzione delle MSC per uso clinico verrà effettuata nella Cell Factory di Verona, afferente al Dipartimento Interaziendale di Medicina Trasfusionale presso il Policlinico G.B. Rossi. Durante questi anni, è stato messo a punto un pannello di saggi su campioni di midollo osseo da 5 donatori sani espansi in Cell Factory; i risultati ottenuti sono i seguenti: 1) le analisi della vitalità e del fenotipo hanno dimostrato il mantenimento dell’identità delle MSC al termine del processo di espansione; 2) la ricerca di virus, micoplasma, funghi o specie microbiche ha rivelato l’assenza di contaminazione e quindi la generazione di un prodotto sterile; 3) in seguito all’aggiunta di stimoli specifici, le MSC prodotte sono in grado di differenziare in adipociti ed osteoblasti; 4) la capacità clonogenica viene mantenuta anche dopo espansione; 5) le proprietà immunomodulatorie delle MSC nei confronti dei principali effettori immuni sono state confermate anche dopo espansione; 6) l’analisi dell’espressione genica e il test di mutagenesi hanno dimostrato l’assenza di trasformazione neoplastica al termine del processo produttivo; 7) la valutazione del cariotipo non ha evidenziato aberrazioni cromosomiche nel prodotto cellulare. I suddetti test sono stati convalidati e dichiarati come controlli di qualità definitivi del protocollo clinico “Ricostruzione di deficit dell’osso scafoide mediante l’uso di cellule staminali mesenchimali autologhe espanse ex-vivo”(Eudract N°2012-002424-33), che è stato sottoposto all’approvazione dell’ISS (Istituto Superiore di Sanità) e dell’AIFA (Agenzia Italiana del Farmaco), che sono gli organi preposti al controllo delle sperimentazioni cliniche.

Over the last 25 years, there has been a growing interest towards regenerative medicine and this has led to the development of a new category of medicinal products based on the use of cells, grouped under the name of “Advanced Therapies”. The European Regulation N°1394/2007 classified three kinds of Advanced Therapy Medicinal Products: “gene therapy medicinal products”, “somatic cell therapy medicinal products” and “tissue engineered products”. Aim of cellular therapies in regenerative medicine is to treat or prevent human diseases through the pharmacological, immunological or metabolic action of the cells. Mesenchymal Stromal Cells (MSC) are key candidates for cellular therapies for different reasons: they are multipotent cells easy to obtain from different tissues; they expand rapidly in culture and produce trophic factors which modulate inflammation, tissue remodeling and apoptosis; they possess immune regulatory properties. The employment of these cells in clinical trials requires in vivo studies to test their efficacy, and their manufacturing, like any kind of injectable drug, must follow GMP (Good Manufacturing Practice) rules, which regulate precisely processes, final product characterization and quality controls. All steps in MSC manufacturing need to be standardized to ensure a reproducible cellular quality and potency assessment. Aim of this work is the demonstration of the safety of MSCs for bone regeneration and is focused on the standardization of quality controls necessary for their use in patients. Starting from pre-clinical data obtained in collaboration with the group of Burastero G., who performed in vivo experiments in animals demonstrating the ability of MSCs to induce bone regeneration, we developed a phase I clinical protocol for the treatment of scaphoid bone defects with autologous MSCs ex-vivo expanded, associated with Orthoss® ( an inorganic bone matrix of bovine origin) and BMP-7 (Osigraft, osteoinductive human recombinant protein). The production of clinical-grade MSCs will be carried out in the Cell Factory of the AOUI of Verona, located at “U.O.C. di Medicina Trasfusionale” of the Policlinico G.B. Rossi, Verona. We set up a panel of assays using five different bone marrow samples from healthy donors expanded in Cell Factory and we obtained the following results: 1) the analyses of viability and phenotype showed the preservation of the identity of MSC after the expansion; 2) the analysis on the presence of endotoxin, viruses, fungi or microbial species demonstrated no contamination and a sterile cellular product; 3) after the addiction of specific stimuli, the MSCs were able to differentiate into osteoblasts and adipocytes; 4) the clonogenicity of MSCs after expansion was maintained; 5) the immunomodulatory properties towards the immune effector cells were confirmed; 6) the gene expression analysis and the mutagenesis test demonstrated the absence of neoplastic transformation after the expansion process; 7) the karyotype analysis showed no chromosomal aberrations in the cellular product. All these validated tests have become the definitive quality controls of the clinical protocol “Ricostruzione di deficit dell’osso scafoide mediante l’uso di cellule staminali mesenchimali autologhe espanse ex-vivo”(Eudract N°2012-002424-33), which has been submitted to the approval of the responsible organs, i.e. ISS (Istituto Superiore di Sanità) and AIFA (Agenzia Italiana del Farmaco).