Investigation on reduction selenium oxyanions, an enigmatic reaction in the biogeochemical selenium cycle.

Il selenio (Se) è un elemento chimico affine allo zolfo ed al tellurio, che, in tracce, risulta essenziale per molti organismi, compreso l’uomo. Tuttavia, a dosi di poco eccedenti la soglia ottimale, 50 μg Se/giorno, esso può risultare tossico (Barceloux, 1999): sono sufficienti 400 μg di Se/giorno per superare la soglia della tossicità (WHO, 1996). Diventa quindi essenziale un accurato controllo di questo elemento nell'ambiente. che pur essendo diffusamente distribuito sulla crosta terrestre, si trova in basse concentrazioni sia nel suolo che nelle acque e, in misura ancor più limitata, nell'atmosfera. La diffusione di questo metalloide nell'ambiente è però associata non solo a processi geologici e idrologici quali I'erosione delle rocce o Ie emissioni vulcaniche, ma anche ad attività antropiche di tipo industriale oltre che di tipo agricolo attraverso l’irrigazione di suoli con elevato contenuto in selenio, che possono incrementarne la solubilizzazione e la mobilità (Fernandez-Martez et al., 2009; Vincenti et al., 2001). Le principali forme di selenio che si diffondono in tal modo nell’ambiente sono gli ossianioni selenito (Se+4, SeO32-) e selenato (Se+6, SeO42-), che costituiscono le specie chimiche del selenio maggiormente tossiche, in quanto altamente solubili e quindi maggiormente biodisponibili (Dungan and Frankenberger, 1999). Tra queste, il selenito risulta essere la specie maggiormente tossica in ambiente aerobio (Zannoni et al., 2008). Al contrario, il selenio elementare , la forma ridotta, risulta meno solubile e quindi meno biodisponibile. La trasformazione delle forme più ossidate e solubili quali selenito e selenato, a forme più ridotte e meno biodisponibili come il selenio elementare, viene catalizzata prevalentemente da microganismi all'interno del ciclo biogeochimico del selenio. Sono stati identificati parecchi microrganismi capaci di ridurre selenito a selenio elementare, sia in ambiente aerobio che anaerobio (Li et al., 2013; Hunter et al., 2008; Hunter et al., 2007; Mishra et al., 2011; Lortie et al., 1992). In alcuni di questi microrganismi, in ambiente anaerobio, questo processo ha una funzione respiratoria, dove il selenito viene utilizzato come accettore di elettroni (Pierru et al., 2006). In ambiente aerobio, invece, la funzione di questa riduzione è tuttora in discussione, non essendo legata a nessun processo energetico (Ike et al., 2000; Tomei et al., 1995). Nonostante questo processo di “riduzione detossificante” sia stato identificato in parecchi microrganismi, al momento risulta ancora poco compreso. Scopo di questo lavoro è un'indagine sul meccanismo di riduzione del selenito catalizzata da microrganismi in ambiente aerobio e all'interno del ciclo biogeochimico del selenio, per fare luce sul meccanismo di “riduzione detossificante”. Per questo studio sono stati utilizzati cinque ceppi di Stenotrophomonas spp.: il ceppo SelTE02, isolato dalla rizosfera di Astragalus bisulcatus una pianta iperaccumulatrice di selenio; il ceppo A16, isolato da suolo di un'area industriale a nord di Trento, contaminata con piombo tetraetile; i ceppi AW, B e T isolati dal sito industriale di Scarlino, un'area altamente contaminata da diversi elementi, tra cui arsenico piombo. Tutte le linee batteriche sono state prima di tutto caratterizzate per la loro resistenza al selenito (Lethal Dose 50, LD50) capacità nel ridurre il selenito a selenio elementare. Tutte le linee batteriche si sono dimostrate capaci di ridurre il selenito a selenio elementare con la formazione di un precipitato rosso a causa di nanoparticelle di selenio elementare: il ceppo SelTE02 ha mostrato la miglior efficienza nella reazione di riduzione, sia in termini di velocità che di percentuale di prodotto ridotto. La valutazione del selenio elementare prodotto ha mostrato per tutte le linee analizzate,la presenza di una diversa velocità di scomparsa di selenito nel mezzo rispetto velocità di formazione del selenio elementare. In particolare, la massima differenza tra la velocità di riduzione rispetto velocità di formazione del selenio si evidenzia intorno alle 24 ore di crescita, all'inizio della fase stazionaria. Queste diverse velocità di catalisi si sono viste dipendere infatti non solo dal numero di cellule coinvolte nella reazione, ma anche dalla loro fase di crescita. La formazione delle nanoparticelle di selenio elementare è stata approfondita con l'utilizzo del TEM ( Transmission Electron Microscope) nel ceppo SeITE02. Le immagini hanno mostrato la formazione di nanoparticelle di selenio dopo circa 10 ore di crescita del microrganismo in presenza di selenito nel mezzo ci coltura, confermando quanto evidenziato con i dati biochimici. Le nanoparticelle in questo ceppo sono state viste esclusivamente fuori dalla membrana cellulare, indicando un probabile meccanismo di assemblamento della nanoparticella di selenio esterno alla cellula. La seconda parte di questo studio ha riguardato la misura della resistenza al selenito in relazione alla produzione di esopolisaccaridi (EPS) e il loro possibile coinvolgimento nella reazione di “riduzione detossificante”. Il ceppo A 16 si è dimostrato il più resistente al selenito e anche il miglior produttore di EPS, mentre la linea batterica di SEITE02, che aveva mostrato la miglior efficienza, ha la minor resistenza con la più bassa produzione di esopolisaccaridi. Questa correlazione tra resistenza e quantità di EPS è stata confermata in tutti i ceppi batterici oggetto di questo studio, indicando una possibile relazione tra gli EPS e la reazione di riduzione del selenito. Il ruolo degli EPS nella reazione di riduzione del selenito è stato studiato con un test “in vitro” dove l'attività di riduzione del selenito veniva evidenziata dalla formazione di un precipitato rosso, dato dalla formazione delle nanoparticelle di selenio elementare, ottenuto dell'attività catalitica degli EPS sul selenito presente nel test. Gli EPS estratti dai ceppi SeITE02, A16 e AW hanno mostrato capacità di ridurre “in vitro” il selenito formando selenio elementare, mentre gli EPS dei ceppi B e T non hanno mostrato attività catalitica. Per quel che riguarda linea batterica SeITE02, sono stati quindi ipotizzati almeno due diversi meccanismi di riduzione uno interno alla cellula ad opera della macchina enzimatica cellulare e uno esterno alla cellula, supportato anche dall'attività degli EPS. Tale ipotesi trova sostegno anche nelle immagini ottenute al TEM, dove le nanoparticelle di selenio si accumulano, in questo ceppo, esternamente alla cellula. Il ceppo B invece forma EPS incapaci di riduzione “in vitro”; ciò nonostante anche questo ceppo mostra una correlazione tra formazione di EPS e resistenza. Per questa ragione in questo ceppo è stato ipotizzato un meccanismo di riduzione interno alla cellula, anche sulla basse delle immagini al TEM che mostrano la formazione di nanoparticelle intracellulari. In questo caso gli EPS potrebbero svolgere la loro funzione di difesa della cellula forse legando una buona quantità di selenito nell'ambiente intorno al microrganismo. Nella terza parte del progetto, attraverso l'analisi del proteoma di SeITE02 si è cercato di entrare nel cuore del meccanismo enzimatico. L' estratto proteico nativo di SeITE02 è stato caricato su gel a cui, dopo la corsa elettroforetica, è stato praticato uno zimogramma per identificare la banda capace di ridurre il selenito, formando una macchia rossa sul gel. Dall'analisi in massa delle bande attive, è stato identificato un enzima coinvolto nel ciclo del mercurio, aprendo la strada ad un nuovo filone di ricerca che vede lo studio dell'interazione tra il mercurio con la riduzione del selenito. Infine, l'intero genoma di Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 è stato sequenziato e analizzato con lo scopo di correlare i risultati delle analisi proteomiche e di trovare nuovi spunti di ricerca.

Selenium (Se) is a naturally occurring metalloid element, which is essential to human and other animal health in trace amounts but is harmful in excess (Barceloux, 1999).Of all the elements, selenium has one of the narrowest ranges between dietary deficiency (<40μg day−1) and toxic levels (>400μg day−1) (WHO 1996), which makes it necessary to carefully control intakes by humans and other animals, hence, the importance of understanding the relationships between environmental exposure and health. Because diet is the most important source of selenium in humans, understanding the biogeochemical controls on the distribution and mobility of environmental selenium is key to the assessment of selenium-related health risks (Raab, 2000). High selenium concentrations are associated with some phosphatic rocks, organic-rich black shales, coals, and sulfide mineralization, and with anthropogenic sources of industrial and agricultural activities (Fernandez-Martez et al., 2009; Vinceti et al, 2001). However, health outcomes are not only dependent on the total selenium content of rocks and soils but also on the amount of selenium taken up into plants and animals—the bioavailable selenium. In the environment, selenium occurs in a variety of oxidation state: in particular the water soluble oxyanions selenite (SeO32-) and selenate (SeO42-) are the predominant Se species in aerobic environment and they are also the forms with the highest toxicity level (Zannoni et al., 2008; Shrift, 1964). Among these, selenite is the most toxic inorganic selenium. (Frankenberger et al., 1998; Jayaweera et al.,1996) The lifetime of selenite in soils is closely associated with the microbial activity. In particular, the process of selenite reduction to Se(0) is of great significance for its bioremediation and geochemical cycles (Ma et al., 2007;). A wide variety of microorganisms can reduce selenite to elemental selenium in aerobic and anaerobic condition (Li et al., 2013; Hunter et al., 2008; Hunter et al., 2007; Mishra et al., 2011; Blum et al., 1998; Lortie et al., 1992). In a few microorganisms the reduction of SeO32- can even serve as a respiratory process; though, in the majority of microorganisms studied SeO32- reduction has no apparent respiratory function (Pierru et al., 2006). In biotic reduction pathways, several types of bacteria have been reported to play a role in the detoxification of Se by reducing selenate or selenite to elemental Se (Ike et al., 2000; Tomei et al., 1995).Neverthlesses, the reduction aerobic processes indicated as “detoxification reduction” by which the microbial reduction of selenite is accomplished are poorly understood. Aim of this PhD work is entire in the understanding of the aerobic reduction mechanisms in the biogeochemical cycle of selenium and to shed a new light on the biological “detoxification mechanism” activated by Stenotrophomonas spp strains, improving the knowledges of genetics and biochemistry involved in the selenium pathway of this microorganism. In the present work, Stenotrophomonas maltophilia SelTE02, a strain isolated from the rhizosphere of the selenium hyperaccumulator Astragalus bisulcatus, was analyzed. The strain was able to reduce selenite to elemental selenium in aerobic conditions: this ability offers the possibility of exploitation of this strain in remediation protocols for the treatment of selenium-bearing wastewaters (Di Gregorio et al., 2005). In the first phase of this project, strain SelTE02 was compared with other four environmental strains of Stenotrophomonas spp isolated from contaminated soils. The strains analyzed, in addition to SelTE02, were: - A16: isolated from soil collected from the Ex-SLOI area in Trento-Nord and was obtained by enrichment cultures added with organic lead. - AW, B, T: isolated from soil collected from Scarlino industrial site and were obtained by enrichment cultures added with arsenite. The physiological characterization of these five Stenotrophomonas spp. strains involved the measurement of LD50 (lethal dose 50), selenite reduction efficiency and elemental selenium production. The strain SelTE02 showed the best performance in the selenite reduction efficiency and elemental selenium productionIn addition, in each one of the strains, we observed a gap between selenite reduction and elemental selenium production: in fact, the elemental selenium production rate is always lower than selenite consumption rate and the maximum gap between elemental selenium production and selenite consumption is at 24 hours (except for strain A16), during early stationary phase.The different rate between the elemental selenium production compared to the disappearance of selenite was related not only with the number of microbial cells but also is depending on the growth phases. The selenium nanoparticles formation was investigated with using Transmission Electron Microscope (TEM). The TEM images of the time course show the presence of extremely rare Se particles before 11h from the culture start, according with the biochemical findings. The number of selenium nanoparticles increase over time and the pictures show that reach a maximum number already at 24 h of the growth, in the early stationary phase. Moreover, the TEM analysis indicate the presence of the selenium nanoparticles only in the external part of the cells, suggesting that the nanoparticles are probably form outside the cell. In the second part of the work, the esopolisaccharides (EPS) production and the correlation with the selenite reduction were investigated in the five strains. Strain A16, the most tolerant to selenite, is also the strain that produces the highest amount of exopolysaccharides, while strain SelTE02, the less tolerant isolate, is the strain that produces the lowest quantity of EPS. The positive correlation between the production of EPS and the selenite resistance was confirmed from the analysis of the LD50 data corroborating an interaction between the production of EPS and resistance of all strains to selenite oxyanions. The EPS role in the reduction was performed with EPSs extract from the five strains in “in vitro” reduction assay where the reduction activity has been highlighted because the red selenium precipitate. EPSs extract of A16, SeITE02 and AW strains were able to reduce selenite to elemental selenium forming red nanoparticles while EPS extracts of strain B and T did not show any activity. For the strain SeITE02 at least two different reduction mechanisms it could be postulated to reduce the toxic selenite oxianions to non toxic elemental selenium: inside the cell by the cellular enzymatic machinery and an ancillary catalytic activity implemented by the EPS outside of the cells. The strain B forms EPS unable to form red elemental selenium in vitro: but the correlation between EPS and resistance is clear for this strain too. In this strain nanoparticles are detected inside the cells and seems that the selenium nanoparticles are growing in the cells. For this reason it could be hypothesized a selenite reducing mechanism exclusively inside the cell and the EPS could contribute to protect cells from hostile environments maybe binding a significant amounts of toxic selenite. In the last part of the work, in order to go deeper in the heart of the selenite reaction, proteomic analysis of the cytoplasmic protein fraction of Stenotrophomonas maltophilia strain SelTE02 was carried out, to investigate the enzyme(s) involved in the selenite reduction: the most interesting suggestion, arising from the proteomic analysis, concerns the identification of an enzyme involved in the mercury cycle. This finding has opened the way to new research that explores the possible interaction between mercury and mechanism for the reduction of selenite. Finally, the whole genome of Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 was performed and analyzed to detect known enzymes correlated with selenite reduction and with the proteomic results.