Il tumore della prostata è la seconda causa di morte tumore-correlata nella popolazione maschile dei paesi sviluppati. Evidenze precliniche hanno rivelato che virtualmente tutti i campioni di cancro avanzato della prostata presentano espressione elevata di Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), una proteina trans-membrana con funzione di folato-idrolasi/carbossipeptidasi. Nel 60% questa si associa con l’attivazione basale delle vie di regolazione della sopravvivenza e con l’aumentata espressione di p130CAS, il più importante adattatore nel complesso di segnalazione reclutato da beta1 integrina (beta1). L’elevata espressione di PSMA nel tumore prostatico più aggressivo suggerisce che PSMA abbia un ruolo importante nella crescita e nella progressione del tumore stesso. Abbiamo già riportato che l’aggregazione di PSMA, mediata da anticorpi specifici (cross-linking) induce l’attivazione delle vie di segnalazione RAS-RAC-MAPK, la traslocazione di NF-kB, l’espressione di IL-6 e la proliferazione in cellule LNCaP, un modello cellulare ampiamente utilizzato di tumore prostatico avanzato. In questo lavoro abbiamo studiato alcuni dei meccanismi molecolari necessari per l’attività di segnalazione mediata da PSMA. PSMA ha un dominio intracellulare corto, privo di siti di autofosforilazione o di legame per chinasi o adattatori ed è quindi incapace di trasdurre segnali. Ha tuttavia un sito di legame per Filamin A (FLNa) attivo nella regolazione dell’internalizzazione della molecola. E’ noto che FLNa si associa anche con beta1, regolandone il traffico intracellulare e abbiamo ipotizzato quindi che FLNa potesse mediare una cooperazione tra PSMA e beta1 nell’assemblaggio di una piattaforma di trasduzione. Questa ipotesi è stata verificata nelle seguenti linee cellulari: LNCaP, derivata da metastasi linfonodale ed esprimente PSMA, PC3-PSMA, originata da metastasi ossee, e dalla linea MCF7-PSMA, derivata da carcinoma mammario. PC3-PSMA e MCF7-PSMA sono state transfettate stabilmente con il gene umano PSMA. Inizialmente abbiamo dimostrato che il cross-linking di PSMA induce l’attivazione concomitante delle vie di segnalazione AKT/mTOR/BAD e p38 e ERK1/2 MAPKs nelle tre linee cellulari, indipendentemente dalla loro differente origine. Il ruolo relativo delle singole vie nella sopravvivenza cellulare è stato valutato in LNCaP, mediante l’inibizione farmacologica di PI3K, il principale attivatore di AKT (Wortmannina) o di p38 ed ERK1/2 (miscela di SB202190 e di PD98059 inibitore di MEK1, la chinasi attivante ERK). L’apoptosi, sia reversibile che irreversibile, è stata quantificata rispettivamente mediante analisi citofluorimetrica dell’esposizione di Annexin V o mediante ELISA, misurando il rilascio citosolico dei complessi DNA-istoni. La più significativa e sinergica induzione di apoptosi è stata osservata quando entrambe le vie di segnalazione venivano inibite simultaneamente. Dato che il cross-linking di PSMA regola l’attivazione delle due vie di segnalazione anti-apoptotiche, abbiamo valutato se il cross-linking di PSMA potesse “salvare” le cellule LNCaP dall’apoptosi indotta dalla deprivazione di siero. I risultati hanno chiaramente indicato che effettivamente PSMA esercita questa attività. Inoltre, l’attività anti-apoptotica mediata da PSMA viene abrogata quando è l’attivazione di ERK1/2 o AKT, dimostrando così che l’attività di PSMA dipende dalla sua abilità di attivare queste chinasi. Tra le MAPKs, ERK1/2 sembra prevalere su p38. Come già menzionato, il dominio citoplasmatico di PSMA è, da un punto di vista strutturale, incapace reclutare complessi di trasduzione. Di conseguenza, abbiamo considerato FLNa, beta1 Src e p130CAS come potenziali partners molecolari. L’analisi al microscopio confocale ha indicato che PSMA e beta1 solo strettamente localizzati, in membrana, nella maggior parte delle cellule LNCaP. L’analisi degli immunoprecipitati ottenuti da lisati cellulari di LNCaP, successivamente al cross-linking di PSMA, ha mostrato che beta1 e FLNa venivano co-immunoprecipitate insieme con p130CAS (pp130CAS) e Src (pSrc) in forma fosforilata. Parimenti, PSMA, FLNa, pp130CAS e pSrc venivano co-immunoprecipitate con beta1. Da notare che il cross-linking di PSMA è rapidamente seguito dalla fosforilazione di Src e p130CAS. Studiando la possibile localizzazione delle varie molecole nei “lipid rafts” di membrana di cellule non trattate, abbiamo localizzato PSMA nel compartimento resistente al detergente Lubrol WX (DRMs) insieme con FLNa, beta1, Src e p130CAS fosforilate, ma non con Src e p130CAS non fosforilate, suggerendo così che le DRMs potrebbero rappresentare il compartimento privilegiato per la formazione dei complessi molecolari. Il primo e forse più importante effetto della formazione del complesso di segnalazione di PSMA è l’attivazione di beta1. Come dimostrato mediante citofluorimetria, la bassa espressione dell’epitopo di attivazione di beta1, HUTS-21, nelle tre linee cellulari aumentava drammaticamente dopo 5 minuti dal cross-linking di PSMA, raggiungeva il picco dopo 10 minuti e declinava dopo 20 minuti, mentre l’espressione totale di beta1 rimaneva stabile, indicando così che PSMA e beta1 intrattengono una relazione funzionalenelle cellule di carcinoma prostatico. E’ stato quindi valutato il ruolo funzionale dei differenti partners nell’attivazione di AKT ed ERK1/2 indotta da cross-linking di PSMA mediante silenziamento genico (siRNA) o inibizione dell’attività chinasica indotta da inibitori farmacologici. La cinetica di attivazione di AKT ed ERK1/2 è apparsa significativamente ridotta in cellule LNCaP silenziate per FLNa, per beta1 o per p130CAS, se confrontata con cellule con fenotipo normale (wt), dimostrando così che tutte e tre le molecole sono necessarie per l’attività di segnalazione di PSMA. Un ruolo rilevante viene svolto anche da pSrc, la cui inibizione farmacologica (inibitori SU6656 o PP1), ha ridotto notevolmente la fosforilazione di ERK e di AKT, indotta dall’attivazione di PSMA. Gli effetti del silenziamento di FLNa o di beta1 o di p130CAS sull’attività anti-apoptotica di PSMA sono stati quindi valutati utilizzando colture 3D in Matrigel. Le cellule LNCaP formano colonie in Matrigel, al 4% di Fetal Bovine Serum (FBS). Il numero di colonie viene decisamente aumentato in seguito all’attivazione di PSMA, dimezzato dalla deprivazione di siero, ma completamente ripristinato dopo attivazione di PSMA. Le colonie in assenza di siero hanno mostrato il fenotipo “shrink” delle cellule apoptotiche. Il silenziamento di FLNa non ha influito sul numero di colonie al 4% di FBS, né ha aggravato gli effetti della deprivazione di siero, se confrontate con le cellule wt. Tuttavia, ha abrogato la capacità di PSMA di promuovere la formazione di colonie così come di impedire l’apoptosi nelle due condizioni. Il silenziamento di beta1 o p130CAS ha cambiato drammaticamente la crescita di LNCaP nelle culture 3D. Il numero di colonie al 4% di FBS e allo 0% di FBS è crollato fino a un decimo di quello generato dalle wt e il cross-linking di PSMA ha fallito la sua attività in entrambe le condizioni. Collettivamente, i nostri risultati dimostrano per la prima volta che l’espressione di PSMA conferisce un notevole vantaggio alle cellule di carcinoma prostatico. Il reclutamento di un complesso di segnalazione che include FLNa, beta1, pp130CAS e pSrc, promuove la crescita delle cellule tumorale e contrasta gli stimoli apoptotici. Per quanto riguarda l’attivazione di beta1 nelle cellule silenziate, abbiamo osservato dei risultati decisamente inattesi. L’attivazione di PSMA è stata seguita da una forte attivazione di beta1. Tuttavia, questa attivazione non è mai risultata tempo–dipendente né seguita dall’attivazione di ERK o AKT. Ulteriori indagini sono necessarie a riguardo.

Prostate cancer (PCa) is the second cause of cancer-related death in males of developed countries. Pre-clinical evidence has revealed that virtually all specimens of advanced PCa express great amounts of Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), a transmembrane folate-hydrolase/ carboxypeptidase, associated in 60% of the samples with activation of survival pathways, with an increase of p130CAS, the major scaffolding protein of beta1 integrin signaling complex. Up-regulated PSMA expression in aggressive prostate tumors provides a selective advantage for tumor cells and a role for PSMA in cancer cell growth and progression is therefore envisaged. We have previously reported that PSMA clustering induces RAS-RAC-MAPK pathway activation, NF-kB translocation, IL-6 gene expression and proliferation in LNCaP cells, a widely used cellular model of advanced PCa cells. We here investigated some of the mechanisms required for signaling activity of PSMA. PSMA has a short intracellular cytodomain, devoid of phopshorylation or docking sites for kinase and adaptor and therefore unable to signal directly. However, it exposes a functional recognition site for Filamin A (FLNa). Recent evidence indicates that FLNa associates also with beta1 integrin (beta1) regulating its intracellular trafficking. This led us to make the hypothesis that FLNa could mediate a cooperation between PSMA and beta1 in the assembly of a signaling platform which may mediate, among others, the activation of anti apoptotic pathways. Our cellular system was constituted by the LNCaP cell line, derived from a lymphnodal metastasis and expressing PSMA endogenously, the PC3-PSMA cell line, originated from bone metastasis of PCa and the MCF7-PSMA cell line, derived from breast carcinoma. PC3-PSMA and MCF7-PSMA were stably transfected with the human PSMA gene. In the first part of the work we have investigated the signaling pathways engaged by PSMA activation (PSMA cross-linking), demonstrating that PSMA induced the parallel activation of both AKT/mTOR/BAD and p38 and ERK1/2 MAPKs pathways in the cell lines, irrespectively of their different origin. The relative role of the two pathways in the basal cell survival was evaluated next in LNCaP by using different doses of specific inhibitors of Wortmannin (inhibitor of PI3K, the main activator of AKT) or a mix of SB202190 (inhibitor of p38) and PD 98059 (inhibitor of MEK1, the ERK-activating kinase). Reversible and irreversible apoptosis was quantified respectively by FACS analysis of Annexin V exposure or ELISA measuring the cytosolic release of DNA–hyston complexes. The most significant and synergic induction of apoptosis was observed when both pathways were inhibited simultaneously with a mix of all drugs used at maximal doses. As PSMA cross-linking regulates the activation of the two anti apoptotic pathways we next assayed if PSMA cross-linking could rescue LNCaP from apoptosis induced by serum withdrawal. Results clearly indicated that this was the case. Moreover, PSMA-induced rescue could be abrogated, by inhibiting MAPK p38 or ERK1/2 or PI3K pathways, thus demonstrating the PSMA activity depended on its ability to activate AKT, p38 and ERK1/2. Among MAPKs, ERK1/2 seemed to prevail on p38. As previously mentioned, PSMA cytodomain is by structurally unable to start the assembly of a signaling complex. We therefore considered FLNa, beta1, Src and p130CAS as potential molecular partners. Confocal analysis indicated that PSMA and beta1 were located in close proximity on the membrane of the majority of LNCaP cells. Immunoblotting of immunoprecipitates prepared from cell lysate of LNCaP cells after PSMA activation, showed that beta1 and FLNa could be pulled down from PSMA IPs, together with phopsphorylated p130CAS and Src. Conversely, PSMA, FLNa, pp130CAS and pSrc could be pulled down from beta1 IPs. Noteworthy, PSMA activation was rapidly followed by Src and p130CAS phosphorylation. In investigating possible location of the various molecules in the lipid rafts of untreated cells we found PSMA in Lubrol WX-detergent resistant membranes (DRMs) with FLNa, beta1, phosphorylated Src and p130CAS, but not with not phosphorylated Src and p130CAS, thus suggesting that DRMs could be a privileged membrane location for the complex formation. The first and perhaps most important effect of this complex assembly was the beta1 activation. As assessed by cytofluorometry, the very low expression of HUTS-21 activation epitope on beta1, in all the three PSMA-positive cell lines analysed, raised dramatically 5 min after PSMA cross-linking, peaked at 10 min and declined at 20 min whereas the total expression of beta1 remained stable throughout the experimental time, thus indicating that PSMA and beta1 entertained a very remarkable relationship in PCa cells. The role of the different partners of the PSMA-signaling complex, in the anti-apoptotic activity, was determined by siRNA silencing or chemical blockage. The phosphorylation of AKT and ERK1/2, induced by PSMA cross-linking, was greatly and significantly reduced at all points of the time courses in FLNa or beta1 or p130CAS silenced LNCaP if compared to the wt cells, thus demonstrating that both molecules were required for PSMA signaling activity. Src activity was as well needed, as specific Src inhibition, induced by SU6656 or PP1 drug, inhibited ERK phosphorylation and AKT phosphorylation, induced by PSMA activation. The effects of FLNa or beta1 or p130CAS silencing on PSMA-mediated rescue from apoptosis, were assayed by using 3D cultures. LNCaP cells do formed colonies in Matrigel at 4% FBS. The number of colonies was strongly increased upon PSMA activation, halved by serum deprivation but was fully restored if PSMA was activated. Colonies in starved samples showed the “shrinking” phenotype of apoptotic cells. FLNa silencing did not affect the ability of LNCaP cells to form colonies at 4% FBS, nor aggravated the effects of starvation if compared to wt cells. However, it abrogated the promoting/rescuing effect of PSMA cross-linking in the two conditions. Beta1 or p130CAS silencing changed dramatically the LNCaP growth in 3D culture. The number of colonies at 4% FBS and at 0% FBS dropped down up to one tenth of that of wt cells and PSMA cross-linking lacked activity in both conditions. Very unexpected results were instead observed regarding the beta1 activation in LNCaP, PC3-PSMA and MCF7-PSMA cells silenced for FLNa or p130CAS. PSMA activation was followed by a strong activation of beta1. However, this activation was not anymore time-dependent, nor followed by activation of ERK or AKT. More investigation is needed on this matter. In all, our results demonstrate for the first time that PSMA expression gives a remarkable advantage to PCa cells by recruiting a signaling complex, including FLNa, beta1, p130CAS and Src, and thereby supporting the activation of antiapototic and pro-proliferative signaling pathways.

Prostate Specific Membrane Antigen associates with Filamin A, beta1 integrin, pp130CAS and pSrc regulating beta1 integrin activation and survival of prostate cancer cells.

Perico, Maria Elisa
2014-01-01

Abstract

Prostate cancer (PCa) is the second cause of cancer-related death in males of developed countries. Pre-clinical evidence has revealed that virtually all specimens of advanced PCa express great amounts of Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), a transmembrane folate-hydrolase/ carboxypeptidase, associated in 60% of the samples with activation of survival pathways, with an increase of p130CAS, the major scaffolding protein of beta1 integrin signaling complex. Up-regulated PSMA expression in aggressive prostate tumors provides a selective advantage for tumor cells and a role for PSMA in cancer cell growth and progression is therefore envisaged. We have previously reported that PSMA clustering induces RAS-RAC-MAPK pathway activation, NF-kB translocation, IL-6 gene expression and proliferation in LNCaP cells, a widely used cellular model of advanced PCa cells. We here investigated some of the mechanisms required for signaling activity of PSMA. PSMA has a short intracellular cytodomain, devoid of phopshorylation or docking sites for kinase and adaptor and therefore unable to signal directly. However, it exposes a functional recognition site for Filamin A (FLNa). Recent evidence indicates that FLNa associates also with beta1 integrin (beta1) regulating its intracellular trafficking. This led us to make the hypothesis that FLNa could mediate a cooperation between PSMA and beta1 in the assembly of a signaling platform which may mediate, among others, the activation of anti apoptotic pathways. Our cellular system was constituted by the LNCaP cell line, derived from a lymphnodal metastasis and expressing PSMA endogenously, the PC3-PSMA cell line, originated from bone metastasis of PCa and the MCF7-PSMA cell line, derived from breast carcinoma. PC3-PSMA and MCF7-PSMA were stably transfected with the human PSMA gene. In the first part of the work we have investigated the signaling pathways engaged by PSMA activation (PSMA cross-linking), demonstrating that PSMA induced the parallel activation of both AKT/mTOR/BAD and p38 and ERK1/2 MAPKs pathways in the cell lines, irrespectively of their different origin. The relative role of the two pathways in the basal cell survival was evaluated next in LNCaP by using different doses of specific inhibitors of Wortmannin (inhibitor of PI3K, the main activator of AKT) or a mix of SB202190 (inhibitor of p38) and PD 98059 (inhibitor of MEK1, the ERK-activating kinase). Reversible and irreversible apoptosis was quantified respectively by FACS analysis of Annexin V exposure or ELISA measuring the cytosolic release of DNA–hyston complexes. The most significant and synergic induction of apoptosis was observed when both pathways were inhibited simultaneously with a mix of all drugs used at maximal doses. As PSMA cross-linking regulates the activation of the two anti apoptotic pathways we next assayed if PSMA cross-linking could rescue LNCaP from apoptosis induced by serum withdrawal. Results clearly indicated that this was the case. Moreover, PSMA-induced rescue could be abrogated, by inhibiting MAPK p38 or ERK1/2 or PI3K pathways, thus demonstrating the PSMA activity depended on its ability to activate AKT, p38 and ERK1/2. Among MAPKs, ERK1/2 seemed to prevail on p38. As previously mentioned, PSMA cytodomain is by structurally unable to start the assembly of a signaling complex. We therefore considered FLNa, beta1, Src and p130CAS as potential molecular partners. Confocal analysis indicated that PSMA and beta1 were located in close proximity on the membrane of the majority of LNCaP cells. Immunoblotting of immunoprecipitates prepared from cell lysate of LNCaP cells after PSMA activation, showed that beta1 and FLNa could be pulled down from PSMA IPs, together with phopsphorylated p130CAS and Src. Conversely, PSMA, FLNa, pp130CAS and pSrc could be pulled down from beta1 IPs. Noteworthy, PSMA activation was rapidly followed by Src and p130CAS phosphorylation. In investigating possible location of the various molecules in the lipid rafts of untreated cells we found PSMA in Lubrol WX-detergent resistant membranes (DRMs) with FLNa, beta1, phosphorylated Src and p130CAS, but not with not phosphorylated Src and p130CAS, thus suggesting that DRMs could be a privileged membrane location for the complex formation. The first and perhaps most important effect of this complex assembly was the beta1 activation. As assessed by cytofluorometry, the very low expression of HUTS-21 activation epitope on beta1, in all the three PSMA-positive cell lines analysed, raised dramatically 5 min after PSMA cross-linking, peaked at 10 min and declined at 20 min whereas the total expression of beta1 remained stable throughout the experimental time, thus indicating that PSMA and beta1 entertained a very remarkable relationship in PCa cells. The role of the different partners of the PSMA-signaling complex, in the anti-apoptotic activity, was determined by siRNA silencing or chemical blockage. The phosphorylation of AKT and ERK1/2, induced by PSMA cross-linking, was greatly and significantly reduced at all points of the time courses in FLNa or beta1 or p130CAS silenced LNCaP if compared to the wt cells, thus demonstrating that both molecules were required for PSMA signaling activity. Src activity was as well needed, as specific Src inhibition, induced by SU6656 or PP1 drug, inhibited ERK phosphorylation and AKT phosphorylation, induced by PSMA activation. The effects of FLNa or beta1 or p130CAS silencing on PSMA-mediated rescue from apoptosis, were assayed by using 3D cultures. LNCaP cells do formed colonies in Matrigel at 4% FBS. The number of colonies was strongly increased upon PSMA activation, halved by serum deprivation but was fully restored if PSMA was activated. Colonies in starved samples showed the “shrinking” phenotype of apoptotic cells. FLNa silencing did not affect the ability of LNCaP cells to form colonies at 4% FBS, nor aggravated the effects of starvation if compared to wt cells. However, it abrogated the promoting/rescuing effect of PSMA cross-linking in the two conditions. Beta1 or p130CAS silencing changed dramatically the LNCaP growth in 3D culture. The number of colonies at 4% FBS and at 0% FBS dropped down up to one tenth of that of wt cells and PSMA cross-linking lacked activity in both conditions. Very unexpected results were instead observed regarding the beta1 activation in LNCaP, PC3-PSMA and MCF7-PSMA cells silenced for FLNa or p130CAS. PSMA activation was followed by a strong activation of beta1. However, this activation was not anymore time-dependent, nor followed by activation of ERK or AKT. More investigation is needed on this matter. In all, our results demonstrate for the first time that PSMA expression gives a remarkable advantage to PCa cells by recruiting a signaling complex, including FLNa, beta1, p130CAS and Src, and thereby supporting the activation of antiapototic and pro-proliferative signaling pathways.
2014
PSMA; integrin; survival; cancer; prostate
Il tumore della prostata è la seconda causa di morte tumore-correlata nella popolazione maschile dei paesi sviluppati. Evidenze precliniche hanno rivelato che virtualmente tutti i campioni di cancro avanzato della prostata presentano espressione elevata di Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), una proteina trans-membrana con funzione di folato-idrolasi/carbossipeptidasi. Nel 60% questa si associa con l’attivazione basale delle vie di regolazione della sopravvivenza e con l’aumentata espressione di p130CAS, il più importante adattatore nel complesso di segnalazione reclutato da beta1 integrina (beta1). L’elevata espressione di PSMA nel tumore prostatico più aggressivo suggerisce che PSMA abbia un ruolo importante nella crescita e nella progressione del tumore stesso. Abbiamo già riportato che l’aggregazione di PSMA, mediata da anticorpi specifici (cross-linking) induce l’attivazione delle vie di segnalazione RAS-RAC-MAPK, la traslocazione di NF-kB, l’espressione di IL-6 e la proliferazione in cellule LNCaP, un modello cellulare ampiamente utilizzato di tumore prostatico avanzato. In questo lavoro abbiamo studiato alcuni dei meccanismi molecolari necessari per l’attività di segnalazione mediata da PSMA. PSMA ha un dominio intracellulare corto, privo di siti di autofosforilazione o di legame per chinasi o adattatori ed è quindi incapace di trasdurre segnali. Ha tuttavia un sito di legame per Filamin A (FLNa) attivo nella regolazione dell’internalizzazione della molecola. E’ noto che FLNa si associa anche con beta1, regolandone il traffico intracellulare e abbiamo ipotizzato quindi che FLNa potesse mediare una cooperazione tra PSMA e beta1 nell’assemblaggio di una piattaforma di trasduzione. Questa ipotesi è stata verificata nelle seguenti linee cellulari: LNCaP, derivata da metastasi linfonodale ed esprimente PSMA, PC3-PSMA, originata da metastasi ossee, e dalla linea MCF7-PSMA, derivata da carcinoma mammario. PC3-PSMA e MCF7-PSMA sono state transfettate stabilmente con il gene umano PSMA. Inizialmente abbiamo dimostrato che il cross-linking di PSMA induce l’attivazione concomitante delle vie di segnalazione AKT/mTOR/BAD e p38 e ERK1/2 MAPKs nelle tre linee cellulari, indipendentemente dalla loro differente origine. Il ruolo relativo delle singole vie nella sopravvivenza cellulare è stato valutato in LNCaP, mediante l’inibizione farmacologica di PI3K, il principale attivatore di AKT (Wortmannina) o di p38 ed ERK1/2 (miscela di SB202190 e di PD98059 inibitore di MEK1, la chinasi attivante ERK). L’apoptosi, sia reversibile che irreversibile, è stata quantificata rispettivamente mediante analisi citofluorimetrica dell’esposizione di Annexin V o mediante ELISA, misurando il rilascio citosolico dei complessi DNA-istoni. La più significativa e sinergica induzione di apoptosi è stata osservata quando entrambe le vie di segnalazione venivano inibite simultaneamente. Dato che il cross-linking di PSMA regola l’attivazione delle due vie di segnalazione anti-apoptotiche, abbiamo valutato se il cross-linking di PSMA potesse “salvare” le cellule LNCaP dall’apoptosi indotta dalla deprivazione di siero. I risultati hanno chiaramente indicato che effettivamente PSMA esercita questa attività. Inoltre, l’attività anti-apoptotica mediata da PSMA viene abrogata quando è l’attivazione di ERK1/2 o AKT, dimostrando così che l’attività di PSMA dipende dalla sua abilità di attivare queste chinasi. Tra le MAPKs, ERK1/2 sembra prevalere su p38. Come già menzionato, il dominio citoplasmatico di PSMA è, da un punto di vista strutturale, incapace reclutare complessi di trasduzione. Di conseguenza, abbiamo considerato FLNa, beta1 Src e p130CAS come potenziali partners molecolari. L’analisi al microscopio confocale ha indicato che PSMA e beta1 solo strettamente localizzati, in membrana, nella maggior parte delle cellule LNCaP. L’analisi degli immunoprecipitati ottenuti da lisati cellulari di LNCaP, successivamente al cross-linking di PSMA, ha mostrato che beta1 e FLNa venivano co-immunoprecipitate insieme con p130CAS (pp130CAS) e Src (pSrc) in forma fosforilata. Parimenti, PSMA, FLNa, pp130CAS e pSrc venivano co-immunoprecipitate con beta1. Da notare che il cross-linking di PSMA è rapidamente seguito dalla fosforilazione di Src e p130CAS. Studiando la possibile localizzazione delle varie molecole nei “lipid rafts” di membrana di cellule non trattate, abbiamo localizzato PSMA nel compartimento resistente al detergente Lubrol WX (DRMs) insieme con FLNa, beta1, Src e p130CAS fosforilate, ma non con Src e p130CAS non fosforilate, suggerendo così che le DRMs potrebbero rappresentare il compartimento privilegiato per la formazione dei complessi molecolari. Il primo e forse più importante effetto della formazione del complesso di segnalazione di PSMA è l’attivazione di beta1. Come dimostrato mediante citofluorimetria, la bassa espressione dell’epitopo di attivazione di beta1, HUTS-21, nelle tre linee cellulari aumentava drammaticamente dopo 5 minuti dal cross-linking di PSMA, raggiungeva il picco dopo 10 minuti e declinava dopo 20 minuti, mentre l’espressione totale di beta1 rimaneva stabile, indicando così che PSMA e beta1 intrattengono una relazione funzionalenelle cellule di carcinoma prostatico. E’ stato quindi valutato il ruolo funzionale dei differenti partners nell’attivazione di AKT ed ERK1/2 indotta da cross-linking di PSMA mediante silenziamento genico (siRNA) o inibizione dell’attività chinasica indotta da inibitori farmacologici. La cinetica di attivazione di AKT ed ERK1/2 è apparsa significativamente ridotta in cellule LNCaP silenziate per FLNa, per beta1 o per p130CAS, se confrontata con cellule con fenotipo normale (wt), dimostrando così che tutte e tre le molecole sono necessarie per l’attività di segnalazione di PSMA. Un ruolo rilevante viene svolto anche da pSrc, la cui inibizione farmacologica (inibitori SU6656 o PP1), ha ridotto notevolmente la fosforilazione di ERK e di AKT, indotta dall’attivazione di PSMA. Gli effetti del silenziamento di FLNa o di beta1 o di p130CAS sull’attività anti-apoptotica di PSMA sono stati quindi valutati utilizzando colture 3D in Matrigel. Le cellule LNCaP formano colonie in Matrigel, al 4% di Fetal Bovine Serum (FBS). Il numero di colonie viene decisamente aumentato in seguito all’attivazione di PSMA, dimezzato dalla deprivazione di siero, ma completamente ripristinato dopo attivazione di PSMA. Le colonie in assenza di siero hanno mostrato il fenotipo “shrink” delle cellule apoptotiche. Il silenziamento di FLNa non ha influito sul numero di colonie al 4% di FBS, né ha aggravato gli effetti della deprivazione di siero, se confrontate con le cellule wt. Tuttavia, ha abrogato la capacità di PSMA di promuovere la formazione di colonie così come di impedire l’apoptosi nelle due condizioni. Il silenziamento di beta1 o p130CAS ha cambiato drammaticamente la crescita di LNCaP nelle culture 3D. Il numero di colonie al 4% di FBS e allo 0% di FBS è crollato fino a un decimo di quello generato dalle wt e il cross-linking di PSMA ha fallito la sua attività in entrambe le condizioni. Collettivamente, i nostri risultati dimostrano per la prima volta che l’espressione di PSMA conferisce un notevole vantaggio alle cellule di carcinoma prostatico. Il reclutamento di un complesso di segnalazione che include FLNa, beta1, pp130CAS e pSrc, promuove la crescita delle cellule tumorale e contrasta gli stimoli apoptotici. Per quanto riguarda l’attivazione di beta1 nelle cellule silenziate, abbiamo osservato dei risultati decisamente inattesi. L’attivazione di PSMA è stata seguita da una forte attivazione di beta1. Tuttavia, questa attivazione non è mai risultata tempo–dipendente né seguita dall’attivazione di ERK o AKT. Ulteriori indagini sono necessarie a riguardo.
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