EFFECTS OF DUPLEX-SPECIFIC NUCLEASE ON HUMAN CELL GENE EXPRESSION PROFILING USING RNA-SEQ

RNA-seq è un metodo che appartiene alla categoria delle procedure di nuova generazione in grado di caratterizzare nel dettaglio i profili d'espressione genica e di effettuare uno studio accurato dell'analisi differenziale dei geni. Ci sono alcune condizioni nelle quali RNA-seq mostra dei limiti, come quella dove i tipi cellulari da studiare esprimono pochi trascritti a livelli molto elevati. L'espressione elevata di alcuni geni potrebbe sia influenzare la stima dell'espressione relativa dei geni meno espressi che ridurre l'accuratezza di tale stima. Pertanto, sarebbe utile riuscire ad applicare un metodo grazie al quale la variabilità dei livelli d'espressione di ogni trascritto non dipenderebbe dai pochi, ma abbondanti, trascritti. Un metodo efficiente di deplezione del cDNA, già utilizzato in altri studi, è chiamato duplex-specific nuclease (DSN). Il metodo DSN è basato sulla denaturazione del cDNA, ibridizzazione e degradazione della doppia elica del DNA. Sono stati presi in esame tre tipi cellulari umani diversi: sangue periferico, monociti e cheratinociti. Da ogni tipo cellulare sono state prodotte due librerie di cDNA (librerie non trattate), per un totale di 6 librerie. Una metà di ciascuna libreria è stata successivamente trattata con DSN, dando luogo ad altre 6 librerie (librerie trattate). In totale sono state predisposte 12 librerie di cDNA (6 librerie non trattate e 6 trattate). In seguito alla preparazione delle librerie è stato effettuato il sequenziamento e l'allineamento sul genoma di riferimento. Infine, dopo opportuni controlli di qualità, sono state eseguite le analisi statistiche. Nel sangue periferico I trascritti più abbondanti sono risultati essere le globine (HBA2, HBA1 e HBB), sia nelle librerie trattate che in quelle non trattate, contando per un ~70% del numero totale delle read (i.e. brevi segmenti di nucleotidi) disponibili per l'esperimento. In quest'ultimo tipo cellulare sono stati osservati gli effetti maggiori del trattamento con DSN. Nei monociti i livelli dei trascritti più abbondanti sono risultati essere circa 10 volte inferiori rispetto alle globine trovate nel sangue periferico. Invece sembra che nei cheratinociti l'espressione genica non sia stata influenzata dal trattamento delle librerie con DSN. L'utilizzo di DSN ha portato ad una riduzione significativa delle globine nei campioni del sangue e, anche se con risultati inferiori, dei geni più espressi nei monociti. Concludiamo che l'impiego di DSN è appropriato per gli esperimenti con geni che presentano espressioni geniche elevate siccome permette di individuare più geni DE rispetto agli esperimenti di RNA-seq non trattati con DSN.

RNA-seq is a next-generation sequencing technology able to characterize thoroughly gene expression profiles and to perform very accurate differential gene expression (DE) analysis. In some experimental conditions RNA-seq displays limitations, such as in studies with few, but extremely high, transcript expression. High expression of few genes could both influence the measurement of relative expression of less expressed genes, as well as reduce the estimate accuracy of gene expression levels of low expressed genes. Therefore, it would be convenient to apply a method by which variability of the expression level of each transcript does not depend on few highly expressed transcripts. Thus a cDNA depletion method for the most represented transcripts called duplex-specific nuclease (DSN) has been effectively used in this study. DSN technique is based on cDNA denaturation, slow hybridization and degradation of double-stranded DNA. To investigate the performances of DSN treatment on different cell types we studied three different cell types: whole blood, monocytes and keratinocytes. From each cell type two cDNA libraries were produced (untreated libraries), for a total of 6 libraries. A half of each library was then treated with DSN, producing a total of 6 DSN treated libraries. Overall, 12 cDNA libraries (6 untreated and 6 treated) were prepared. Afterward, the prepared libraries underwent RNA-seq. Quality control checks were carried out and the data analysis was completed. In blood tissue the most abundant transcripts in both DSN-treated and DSN-untreated samples corresponded to globins (HBA2, HBA1 and HBB), accounting for ~70% of total reads (i.e. short sequences of nucleotides). In this sample maximum effects of DSN treatment were observed. Transcripts found to be the most expressed in monocyte sample were ~10 times smaller than globins expression in blood sample. Gene expression of keratinocyte libraries was not influenced by DSN treatment. DSN treatment has been able to strongly reduce globins expression. DSN treatment also reduced, even if with a smaller effect, the most expressed genes in monocyte sample. We conclude that DSN treatment is suitable for samples presenting highly-expressed genes as it allows to observe more DE genes, compared to the untreated RNA-seq samples.