IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF ARABIDOPSIS MUTANT PLANTS IMPAIRED IN NO-MEDIATED HR-CELL DEATH

L'ossido nitrico (NO) è una molecola gassosa radicale e una molecola di segnalazione chiave coinvolto nella mediazione di varie condizioni di sviluppo e di risposta allo stress biotico e abiotico nelle piante. Nell'interazione pianta-patogeno, NO presenta un ruolo cruciale nella difesa contro i microbi biotrofici, lavorando in collaborazione con ROS per innescare la morte cellulare nella zona infetta; un meccanismo noto come risposta ipersensibile (HR). Tuttavia, i meccanismi molecolari di come NO coordina questo processo è ancora sconosciuta. Per identificare i geni coinvolti nella segnalazione NO durante il processo di morte cellulare ipersensibile, abbiamo effettuato uno screening genetico diretto, utilizzando un sistema di doppia selezione per identificare piante mutanti di Arabidopsis compromessi nella signaling di NO durante la morte ipersensibile. Per lo screening primario, una piattaforma di fumigazione di NO è stato sviluppato e in seguito è stato identificato condizioni per innescare la morte cellulare in piante wild-type di Arabidopsis indotta dal trattamento col NO. Fumigando in totale 25.600 M2 piante provenienti dal etil metano sulfonato (EMS) e della popolazione mutante con neutroni (FN), abbiamo identificato 19 linee mutanti compromessi nella morte cellulare indotta dal NO. Il secondo screening consisteva nell'esaminare la riduzione della HR indotta dal patogeno in questi mutanti pre-selezionati. Analizzando 13 linee mutanti, resistenti al’NO, per una diminuzione della morte cellulare innescata dell'infezione con patogeni non virulenti, abbiamo identificato 7 linee mutanti che sono stati alterati in questo processo. Le caratterizzazione dei processi riguardo alla HR è stata eseguita in tre di questi mutanti selezionati. Analizzando il loro sistema antiossidante e la presenza di normale produzione di NO e ROS durante la risposta ipersensibile in queste mutanti è stato possibile allocare la loro mutazione in posizione diversa nella segnalazione di NO durante la risposta di resistenza delle piante. I nostri risultati hanno dimostrato che i tre mutanti mostravano alterazioni nel sistema antiossidante, ciò influenzato negativamente la produzioni di ROS in uno degli mutanti. Inoltre, la sotto regolazione dell'attività della catalase ha contribuito per il loro superiore livello di ROS. A quanto riguarda la produzione di NO, questo è stato ridotto invece in tutte le tre linee ma, solo una linea ha presentato una completamente compromessa produzione di NO. È interessante notare che, in tutti i tre mutanti è stato disturbato la modulazione dell'attività GSNOR durante l’HR. Concludendo, i nostri dati indicano che non solo il livello di produzione di entrambe NO e ROS, ma anche i meccanismi per la loro rimozioni sono stati determinanti per avere il normale sviluppo della morte ipersensibile; e quindi, la strategia di selezione progettato potrebbe anche selezionare mutanti deteriorati in questi processi. In questo modo, questi risultati rinforzano l'importanza di avere biodisponibilità equilibrata tra H2O2 e NO nell'esecuzione della morte cellulare programmata nella risposta di resistenza delle piante al patogeno. La caratterizzazione della produzione di NO e di ROS in altri mutanti identificati permetterà di selezionare mutanti più interessanti da sequenziare. La preparazione della popolazione di mappatura utilizzando piante mutanti M3 originali ad incroci (OC) si ha rivelato di essere negativo per il nostro studio. La presenza di genotipi polimorfici nella popolazione ibrido F2 OC ha prodotto una segregazione genetica distorta, precludendo per determinare in modo inequivocabile il gene mutato. Pertanto, strategia supplementare per l'identificazione della mutazione causale, come l'uso di mutanti F2 backcrossed per la creazione di una popolazione di mappatura, dovrebbe essere considerata una volta che saranno prescelti candidati mutanti migliori.

Nitric oxide (NO) is a gaseous free radical and a key signaling molecule involved in the mediation of various developmental and stress-related conditions in plants. In plant-pathogen interaction, NO plays a crucial role in defense against biotrophic microbes, working together with ROS to trigger cell death in the infected area; a mechanism known as hypersensitive response (HR). However, the molecular mechanisms of how NO coordinates this process is still unknown. To identify candidate genes involved in NO signaling during the HR-cell death process, we carried out a forward genetic screen, using a double-selection system to identify Arabidopsis mutant plants compromised in NO-mediated HR-cell death. For the primary screening, an NO fumigation platform was developed and conditions inducing uniform cell death on wild-type Arabidopsis plants identified. Fumigating in total 25,600 M2 ethyl methane sulfonate (EMS) and fast neutron (FN) mutant plants, we identified 19 mutant lines as non-responsive for NO-induced cell death. The second screening step consisted then, in examining the reduction in pathogen induced HR-cell death in these pre-selected mutants. Evaluation of 13 NO resistant mutant lines for decreased cell death upon avirulent pathogen infection, we finally identified 7 mutant lines that were impaired in this process. An extensive characterization of HR-cell death process was performed in three of these selected mutants. Analyzing the antioxidant system and the presence of normal NO and ROS bursts in these lines, was possible to allocate their mutation in different position in NO signaling in plant resistance. Our results demonstrated that all three mutants showed alteration in the antioxidant system, what affected negatively the ROS burst in one of them. The down-regulation of catalase activity contributed for their higher endogenous level of ROS. Moreover, the NO burst was reduced instead in all three lines but, only one presented a fully compromised NO burst. Interestingly, in all three mutants the modulation of GSNOR activity during HR was disturbed. Concluding, our data indicated that not only the rate of NO and ROS production but also the mechanisms for their turnover were determinant for having normal development of HR-cell death; and therefore, the designed selection strategy also could select mutants impaired in these processes. Thus, these findings reinforce the importance of having balanced bioavailability between H2O2 and NO in the execution of cell death program in plant resistance response. Characterization of NO and ROS in other identified mutants will allow to select most interesting mutants to be sequenced. Mapping population obtained from original M3 mutant plants for outcrossing (OC) revealed to be not the best material for our study. The presence of polymorphic genotypes in the hybrid F2 OC population yielded a distorted genetic segregation and could preclude to determine unequivocally, the mutated gene. Therefore additional strategy for identification of the causal mutation, like the use of F2 backcrossed mutants for creating a mapping population, should be considered once best candidates will be finally selected.