FLAVONOID BIOSYNTHESIS IN GRAPEVINE: THE ROLE OF NOVEL MYB TRANSCRIPTIONAL REGULATORS

L ‘R2R3 MYB è il più grande gruppo di regolatori trascrizionali in pianta. Essi sono coinvolti in differenti processi, come il controllo della produzione di tricomi e peli radicali. Una parte di questi MYB partecipa ad un complesso proteico trascrizionale, che comprende anche una proteina WD40 -repeat (WDR), e una proteina - Helix -Loop - Helix ( bHLH ). I fattori MYB svolgono un ruolo importante in quanto sono i principali responsabili della specificità di azione del complesso. Il complesso MYB - bHLH - WDR può agire sia come un attivatore trascrizionale sia come repressore trascrizionale. La funzione di attivazione comporta la partecipazione del fattore MYB al complesso, che determina l’attivazione della trascrizione di geni target, legandosi direttamente ai loro promotori. Nella repressione, i fattori MYB legandosi al complesso possono reprimere la trascrizione dei geni con diversi meccanismi. In Vitis vinifera il complesso MYB - bHLH - WDR è stato parzialmente studiato in relazione alla via di flavonoidi e alcuni dei fattori MYB hanno un ruolo cruciale nel determinare la regolazione di dell’espressione di enzimi strutturali che appartengono a specifiche ramificazione della via dei flavonoidi. Ad esempio VvMYBA1 e VvMYBA2 regolano la produzione di antociani, che sono i responsabile della colorazione bacca (Walker et al. , 2007), mentre VvMYBPA1 e VvMYBPA2 regolano la produzione di proantocianidine, una via biosintetica che di dirama dalla della via dei flavonoidi. Grazie all’ultima versione del genoma di vite è stato possibile identificare alcuni geni altamente omologhi a regolatori della biosintesi degli antociani giá caratterizzati. Infatti, nell’albero filogenetico composto da R2R3 MYBs e R3 MYBs di Vitis vinifera abbiamo identificato un clade, dove sono presenti VvMYBA1 e VvMYBA2; ad oggi, oltre a queste proteine MYB, nessun altro fattore MYB appartenente a questo clade è stato caratterizzato. Per questo motivo, the gene omologhi e risiedenti sullo stesso cromosoma (cromosoma 2), sono stati nominati VvMYBA5, VvMYBA6, e VvMYBA7 e scelti per le successive caratterizzazioni, grazie anche all’elevata omologia di sequenza con VvMYBA1 e VvMYBA2. Infine, abbiamo ipotizzato che VvMYBA5, VvMYBA6 e VvMYBA7 potrebbero rappresentare dei nuovi regolatori della biosintesi di antociani in organi diversi o in differenti stadi di sviluppo rispetto a VvMYBA1. Abbiamo inoltre identificato un altro clade, chiamato " clade dei repressori " nel quale le proteine sono caratterizzate dalla presenza del motivo repressione. Le informazioni riguardanti i repressori MYB in Vitis vinifera sono scarse e solo un MYB repressore è stato identificato fino ad ora, coinvolto nella repressione della produzione di proantocianidine. Un ulteriore parte del mio progetto di dottorato è la caratterizzazione funzionale di differenti MYB repressori presenti in questo clade, utilizzando approcci diversi come l'espressione eterologa in Petunia hybrida, l’espressione ectopica in radici vite e l’ Yeast two hybrid. I cinque MYB selezionati, denominati VvMYB4a, VvMYB4b , VvMYBC2-L1 , VvMYBC2-L2 e VvMYBC2 - L3, sono stati scelti sulla base della omologia con altri repressori appartenenti a specie diverse e sulla base della presenza di particolari sequenze amminoacidiche caratteristiche dei repressori trascrizionali. Infine, ho iniziato la caratterizzazione di un R3 MYB di vite, chiamato CPC per l’omologia con CPC di Arabidopsis, caratterizzato da

The R2R3 MYB is the largest group of transcriptional regulators in plant. They are involved in different process such as the control of the production of trichomes and root hairs. A part of these MYBs participates to a transcriptional regulatory complex in which includes also a WD40-repeat (WDR) protein and a basic-Helix-Loop-Helix (bHLH) protein. The MYB factor play an important role because it is the major responsible for the specificity of action of the complex. The MYB-bHLH-WDR regulatory complex may act as a transcriptional activator or as a transcriptional repressor: activation function in which MYB activators participate to the complex and activate the transcription of genes by direct binding to their promoters and repression function in which MYB repressors, through different ways, repress the transcription. In Vitis vinifera the MYB-bHLH-WDR complex has been partially studied in relation to the flavonoid pathway, and some MYB factors have been shown to play a role in driving the complex in the activation of specific branches of the pathway. For example, VvMYBA1 and VvMYBA2 are factors responsible for the production of anthocyanin pigments that color the berry skin (Walker et al., 2007), while VvMYBPA1 and VvMYBPA2 are responsible for the production of proanthocyanidins. Thanks to the recently released grape genome we could identify several genes highly homologous to known anthocyanin pathway regulators of other species. In a phylogenetic tree of Vitis vinifera MYB factors there is a clade where VvMYBA1 and VvMYBA2 cluster together with few other MYBs and to date only the MYBA1 and MYBA2 have been characterized. In this clade, three highly homologous genes residing on the same chromosome (Chromosome 2) were named VvMYBA5, VvMYBA6 and VvMYBA7, and chosen for further characterization. Due to the high homology with the characterized VvMYBA1 and VvMYBA2, we hypothesized that they could regulate the anthocyanin synthesis in different organs/stages respect to VvMYBA1. In the same way, we found another clade, called “repressors clade” in witch the proteins are characterized by the presence of the repression motif. The information regarding the MYB repressors in Vitis vinifera is scarce and only one MYB repressor has been identified until now. So another part of my PhD project is the functional characterization of different MYB proteins present in this clade utilizing different approaches as, the heterologous expression in Petunia hybirda, the ectopic overexpression in grapevine hairy roots and the Yeast two hybrid analysis. In details, I choose five different MYB repressors, named VvMYB4a, VvMYB4b, VvMYBC2-L1, VvMYBC2-L2 and VvMYBC2-L3, based on the homology with other repressors belonging to a different species and on particular amino acidic signatures. Moreover, I initiated a study of some MYB proteins belonging to the R2R3 MYB repressor clade, almost completely uncharacterized in grapevine. Finally, I tentatively characterized, a grapevine MYB with a single R3 repeat.