Studio delle vie di segnale coinvolte nello sviluppo di ipertensione polmonare da sovraccarico cronico di volume del ventricolo destro e valutazione degli effetti di un nuovo donatore di ossido nitrico.

Background. Il sovraccarico di volume cronico del ventricolo destro determina a lungo termine la comparsa di un quadro patologico di scompenso ventricolare destro e ipertensione arteriosa polmonare, una condizione emodinamica e fisiopatologica progressiva e complessa caratterizzata da una pressione arteriosa polmonare media a riposo superiore, o uguale, a 25 mmHg, un rimodellamento sostanziale della struttura dei vasi polmonari e un elevato grado di ipertrofia ventricolare destra. Gli esatti meccanismi molecolari coinvolti nell’eziopatogenesi dell’ipertensione arteriosa polmonare, nonché nel rimodellamento ventricolare e vascolare da sovraccarico di volume cronico del ventricolo destro, sono tuttora poco chiari, motivo per cui questa condizione clinica continua a rimanere devastante, con sintomi progressivamente debilitanti ed alta mortalità nella popolazione affetta. Obiettivi. Nella prima fase dello studio (fase di valutazione, osservazionale e descrittiva) sono state eseguite analisi istologiche, biochimiche e molecolari allo scopo di fornire una valutazione approfondita del modello sperimentale di ipertensione polmonare da sovraccarico cronico di volume del ventricolo destro, essenzialmente un modello di ipertensione arteriosa polmonare associata a cardiopatie congenite (sottogruppo 1.4.4). Nella seconda fase dello studio (fase di trattamento) sono stati valutati gli effetti della somministrazione in acuto di albumina nitrosilata, un nuovo agente donatore di ossido nitrico (NO-donor), sull’ipertensione polmonare e sul rimodellamento del ventricolo destro. Metodi. 35 ratti maschi adulti Sprague-Dawley (15 nella prima fase, gruppo SHUNT, 20 nella seconda fase, gruppi SHUNT+HSA e SHUNT+S-NO-HSA) del peso di 400 ± 50 grammi, sono stati sottoposti ad intervento di creazione di una fistola aorto-cavale mentre ratti sham-operated (n=15) sono stati considerati come controlli nella prima fase dello studio. A distanza di 20 settimane dall’operazione, sezioni di ventricolo destro e arteriole polmonari degli animali della prima fase sperimentale (n=5 per gruppo) sono state analizzate con tecniche istologiche, mentre lo stato di fosforilazione di ERK1/2, Akt e cTnI e i livelli di espressione/attivazione di eNOS e iNOS sono stati valutati mediante analisi Western blot su biopsie di ventricolo destro e polmone di tutti i ratti considerati in entrambe le fasi dello studio. L’analisi HPLC ha infine consentito di determinare sugli stessi campioni i rapporti tra glutatione ossidato e ridotto (GSSG/GSH) e il contenuto dei fosfati ad alta energia. Risultati. L’analisi Western blot eseguita su campioni di miocardio ventricolare destro a distanza di 20 settimane dall’esecuzione dello shunt aorto-cavale, ha evidenziato un significativo incremento dei livelli di fosforilazione di ERK1/2 (p<0.001) e di cTnI (p<0.01), una significativa riduzione dello stato di fosforilazione di Akt (p<0.05) e una significativa down-regolazione dei livelli di espressione di iNOS (p<0.05) nel gruppo SHUNT rispetto al gruppo SHAM. I ratti del gruppo SHUNT+S-NO-HSA hanno invece mostrato una significativa riduzione dei livelli di fosforilazione di ERK1/2 (p<0.01) e di cTnI (p<0.01) nel ventricolo destro rispetto al gruppo di controllo SHUNT+HSA, mentre 6 risultano caratterizzati da una significativa up-regolazione dei livelli di espressione di iNOS (p<0.05) dopo 20 settimane di esposizione allo shunt aorto-cavale. I campioni di tessuto polmonare degli animali del gruppo SHUNT, analizzati mediante Western blot a distanza di 20 settimane dalla creazione della fistola aorto-cavale, hanno mostrato un significativo aumento dei livelli di fosforilazione di ERK1/2 (p<0.01) e dell’espressione di iNOS (p<0.05) rispetto ai ratti sham-operated (SHAM), mentre il trattamento in acuto con albumina S-nitrosilata (gruppo SHUNT+S-NO-HSA) ha ulteriormente contribuito ad un sostanziale incremento dei livelli di espressione di iNOS (p<0.05) rispetto ai ratti di controllo (SHUNT+HSA). La persistenza dello shunt aorto-cavale per 20 settimane è risultata indurre un significativo incremento dei livelli di glutatione ossidato (%GSSG, p<0.05) nel ventricolo destro dei ratti SHUNT rispetto ai ratti di controllo SHAM, mentre nessuna variazione statisticamente significativa è stata evidenziata negli animali trattati con S-NO-HSA (SHUNT+S-NO-HSA) rispetto al gruppo di controllo (SHUNT+HSA) dopo 20 settimane di esposizione allo shunt aorto-cavale. Nel tessuto polmonare i livelli di GSSG sono risultati sostanzialmente aumentati (p<0.01) nel gruppo SHUNT rispetto al gruppo SHAM ma significativamente ridotti (p<0.01) in seguito alla somministrazione acuta di S-NO-HSA (gruppo SHUNT+S-NO-HSA) dopo 20 settimane di esposizione allo shunt aorto-cavale. La funzionalità mitocondriale dei cardiomiociti ventricolari destri è risultata complessivamente compromessa (diminuzione di ATP, p<0.05) negli animali del gruppo SHUNT rispetto agli animali sham-operated (SHAM), dopo 20 settimane dall’operazione, con una generale tendenza alla preservazione in seguito al trattamento con S-NO-HSA (gruppo SHUNT+S-NO-HSA) rispetto al gruppo di controllo (SHUNT+HSA). Variazioni significative dei livelli di AMP e ATP (p<0.05, p<0.01 rispettivamente) sono state evidenziate nel tessuto polmonare dei ratti SHUNT rispetto al gruppo SHAM in seguito alla persistenza della fistola aorto-cavale; lo stato energetico polmonare è risultato significativamente preservato (diminuzione AMP: p<0.05; aumento ATP: p<0.01) nel gruppo SHUNT+S-NO-HSA rispetto agli animali non trattati (SHUNT+HSA). Conclusioni. Il modello studiato di sovraccarico cronico di volume del ventricolo destro con progressivo sviluppo di ipertensione polmonare dimostra il coinvolgimento di vie di segnale attivate nella patogenesi dell’insufficienza ventricolare destra con ipertensione del circolo arterioso polmonare e in particolare: -ERK 1/2 nell’ipertrofia cardiaca e della componente vascolare polmonare; -Akt nella sopravvivenza cellulare; -cTnI nella regolazione della funzione contrattile dei cardiomiociti; -eNOS e iNOS nell’omeostasi endoteliale e nella generazione di ossido nitrico. In questo contesto sperimentale, che riproduce condizioni cliniche specifiche, l’utilizzo di un nuovo NO-donor quale la S-NO-HSA per via sistemica in acuto, risulta essere vantaggioso non solo per il profilo emodinamico e biochimico ma poiché attenua le alterazioni di mediatori coinvolti in vie biomolecolari di fondamentale importanza per le possibili implicazioni cliniche.

Background. Chronic volume overload of right ventricle induces right ventricular failure and pulmonary arterial hypertension, a progressive and multifaceted disease process characterized by high morbidity and mortality, high mean pulmonary artery pressure at rest (≥25 mmHg), pulmonary vascular remodeling and right ventricular hypertrophy. The exact molecular mechanisms involved in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension remain still unclear as those underlying the development of chronic volume overload-induced right ventricular and pulmonary vascular remodeling. Objectives. In the first part of the study (evaluation phase) the animal model of right ventricular chronic volume overload-induced pulmonary hypertension was assessed by histological, biochemical and molecular analysis. This model was essentially designed to reproduce a particular clinical condition such as pulmonary arterial hypertension associated with congenital heart diseases (clinical subset 1.4.4). In the second part (treatment phase) the effects of a new NO-donor’s acute administration, S-nitroso-albumin, were evaluated in respect of pulmonary hypertension and right ventricular remodeling. Methods. Aorto-caval shunt was surgically created in 35 adult male Sprague-Dawley rats weighting 400 ± 50 g (first part, SHUNT group, n=15; second part, SHUNT+HSA and SHUNT+S-NO-HSA groups, n=10 each one). Sham-operated rats (n=15) were considered as controls only for the first part of the study (SHAM group). 20 weeks after surgery histological sections were obtained from right ventricles and small pulmonary arteries of SHAM and SHUNT animals (n=5 each group), stained in hematoxylin-eosin and finally analyzed. The phosphorylation status of ERK1/2, Akt and cTnI and protein expression/activation levels of eNOS and iNOS were evaluated by Western blot analysis in right ventricles and lungs of all rats in both phases of the study after 20 weeks from surgery. The same samples were used even to determine the ratios between oxidized and reduced glutathione (GSSG/GSH) and high energy phosphates content by HPLC analysis. Results. Western blot analysis on right ventricular myocardium has shown a significant increase of ERK1/2 and cTnI phosphorylation levels (p<0.001 and p<0.01, respectively), a decrease of Akt phosphorylation (p<0.05) and a significant downregulation of iNOS expression (p<0.05) in SHUNT group compared to the SHAM group, 20 weeks after the aorto-caval shunt. ERK1/2 and cTnI phosphorylation levels were significantly reduced in right ventricle of SHUNT+S-NO-HSA rats compared to the control group (SHUNT+HSA) (p<0.01), while the treatment significantly upregulated the expression of iNOS (p<0.05) after 20 weeks from surgery. As shown by Western blot analysis performed on lung tissue biopsies 20 weeks after the aorto-caval shunt, there was a significant increase of ERK1/2 phosphorylation levels and iNOS expression in SHUNT group compared to sham-operated rats (p<0.01 and p<0.05 respectively), while S-NO-HSA acute administration induced a further increase of iNOS expression in SHUNT+S-NO-HSA group compared to the control (p<0.05). Twenty week-aorto-caval shunt induced a significant increase of oxidixed glutathione levels in right ventricle of SHUNT rats compared to the control group (p<0.05), while no 8 changes were shown after S-NO-HSA treatment compared to the SHUNT+HSA group 20 weeks after surgery. Lung tissue levels of GSSG were significantly increased in SHUNT group (p<0.01) but substantially reduced after acute administration of S-NO-HSA (p<0.01) at 20 weeks from aorto-caval shunt. As shown by the significant decrease of ATP levels in rigth ventricle of SHUNT animals compared to the control group (p<0.05), mitochondrial function of right ventricular cardiomyocytes was substantially reduced after 20 weeks from aorto-caval shunt while seemed to be preserved by the treatment with S-NO-HSA compared to the untreated animals. Significant changes of AMP and ATP content were shown in lung tissue of SHUNT rats compared to the control group (p<0.05, p<0.01 respectively) 20 weeks after the aorto-caval shunt while acute administration of S-NO-HSA significantly preserved lung energy status compared to the untreated group (p<0.05 for the decrease of AMP; p<0.01 for the increase of ATP). Conclusions.This model of right ventricle chronic volume overload with progressive development of pulmonary hypertension showed the involvement of signaling pathways in the pathogenesis of right ventricular failure with pulmonary arterial hypertension, in particular: -ERK 1/2 in cardiac hypertrophy and pulmonary vascular remodelling; -Akt in cell survival; -cTnI in regulation of cardiomyocyte contractile function; -eNOS and iNOS in endothelial homeostasis and nitric oxide generation. In this experimental setting acute administration of a new NO-donor, such as S-NO-HSA, has been shown overall haemodynamic and biochemical effects and a reduction of the altered mediators involved in some pathways of pivotal role in the clinical field.