Il diabete di tipo 1 (T1D), definito anche diabete insulino-dipendente o diabete giovanile, è una malattia cronica nella quale si verifica una progressiva distruzione delle cellule β del pancreas, responsabili della produzione di insulina. La conseguente diminuzione di insulina provoca l’incremento della concentrazione di glucosio nel sangue e l’alterazione del metabolismo dei carboidrati, richiedendo una terapia sostitutiva continua che rende i pazienti totalmente dipendenti da iniezioni insuliniche. L’incidenza in Europa di questa malattia nei bambini al di sotto dei 14 anni varia tra 11 e 25 nuovi casi all’anno ogni 100 000 bambini e i dati epidemiologici indicano che è destinata ad aumentare. La distruzione selettiva delle cellule β pancreatiche è un processo immuno-mediato legato all’inefficienza dei normali meccanismi responsabili del mantenimento della tolleranza verso gli antigeni autologhi, quali l’isoforma da 65 kDa della glutammato decarbossilasi (GAD65) e l’insulina; un ruolo autoantigenico nella malattia è stato inoltre ipotizzato per la proteina heat-shock 60 (HSP60), rilasciata dalle cellule β in seguito a stress. Numerosi studi in modelli animali e in soggetti diabetici o a rischio di sviluppare la malattia, stanno testando la possibilità di prevenirne o bloccarne il decorso attraverso la somministrazione di autoantigeni o loro peptidi immunoreattivi, in grado di indurre un processo di tolleranza immunologica; tale strategia è detta immunoterapia antigene-specifica (ASI). I suoi effetti sono strettamente dipendenti dalla molecola scelta per il trattamento, dalla via di somministrazione e dallo stadio della patologia al momento dell’intervento. Questo approccio consente di eliminare o inattivare dal punto di vista funzionale le cellule T autoreattive in modo selettivo, ovvero senza compromettere la funzionalità del sistema immunitario. Sulla base dei risultati positivi ottenuti nel modello animale (topo NOD - non obeso diabetico), test clinici nell’uomo miranti a valutare l’efficacia della somministrazione di insulina per via orale (NCT00419562) o intranasale (NCT00419562) sono attualmente in corso. Inoltre uno studio in fase II basato sulla somministrazione di GAD65 si sta svolgendo in Svezia, con lo scopo di testare l’efficacia di questa molecola nella prevenzione della malattia in soggetti pre-diabetici (NCT01122446). Oltre che attraverso antigeni interi, la tolleranza immunologica può essere indotta attraverso la somministrazione di peptidi. In particolare è stato dimostrato che il trattamento di topi NOD con microgrammi di peptidi rappresentanti alcuni dei maggiori epitopi T derivanti dagli autoantiantigeni della malattia, può prevenire, ritardare o sopprimere in modo efficace il processo di patogenesi. Un peptide derivante da HSP60 (DiaPep277) è stato già testato in pazienti malati di T1D di recente insorgenza e due studi di fase III attualmente in corso, stanno valutando la sua efficacia nel preservare la funzionalità delle cellule β (NCT00615264 e NCT01103284). Fra i maggiori svantaggi di questo tipo di terapia, vi è l’alto costo associato alla produzione delle molecole di interesse. Nella prospettiva di utilizzo dell’immunoterapia a livello più ampio come strategia di vaccinazione dei soggetti a rischio, è auspicabile lo sviluppo di sistemi che consentano la produzione delle molecole a costi minori rispetto ai sistemi attualmente utilizzati. Nel corso degli ultimi venti anni numerose evidenze sperimentali dimostrano che le piante possono essere utilizzate come biofabbriche per la produzione di molecole di interesse terapeutico, offrendo vantaggi in termini economici e di scalabilità. L’obiettivo generale di questo progetto di dottorato, è la produzione di molecole utilizzabili come putativi vaccini del diabete autoimmune in diverse piattaforme vegetali, con lo scopo di sviluppare sistemi di produzione e purificazione delle molecole di interesse altamente efficienti ed economici. In particolare, diverse forme della GAD65 sono state prodotte in piattaforme vegetali di vario tipo, dimostrando l’applicabilità di questo approccio per la produzione di tale proteina. Inoltre, sfruttando il fatto che i virus vegetali possono essere utilizzati come supporto per l’esposizione di peptidi eterologhi, sono state prodotte particelle virali esponenti sulla loro superficie un epitopo della GAD65 umana, da testare nel modello animale per valutarne l’efficacia nella prevenzione della malattia.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease characterized by the T-cell mediated destruction of insulin-secreting pancreatic β-cells, causing the need of life-long insulin therapy. The autoimmune response is targeted mainly against some proteins present on the β-cells, including the smaller isoform of glutamic acid decarboxylase (GAD65), insulin and the tyrosine phosphate-like IA-2/IA-2B antigen; an autoantigenic role of heat-shock protein 60 (HSP60) released from stressed β-cells has also been demonstrated. Clinical trials are currently testing the possibility of preventing the clinical onset of the disease or delaying the loss of -cell function using immunological strategies based on the induction of tolerance (Tisch & McDevitt, 1994). In this research field, many studies have focused on antigen-specific immunotherapy (ASI), which is based on the delivery of autoantigens or autoantigen-derived peptides at different disease stages and via different routes, resulting in self-tolerance and prevention, delay or suppression of the pathogenic process. ASI is an appealing strategy in autoimmune disease treatment because it selectively inactivates, eliminates, or functionally deviates autoreactive T cells while maintaining the function of the remainder of the immune system (Tisch et al., 1999). The effect is strongly dependent on dose, frequency, route of administration, use of adjuvants, interindividual variations and especially the molecule used for immunization (autoantigen chosen, use of the whole protein or single or mixed peptides) (Peakman et von Herrath, 2010). Given the many potential advantages of this kind of therapy, several studies have been performed by the administration of whole T1D autoantigens or autoantigen peptides, aiming at preventing the disease or suppressing its pathogenic process. In particular, given the promising pre-clinical results obtained in T1D animal model (non obese diabetic -NOD- mouse), human trials based on oral (NCT00419562) and intranasal (NCT00336674) administration of whole insulin are currently underway. A phase II prevention trial based on the use of whole GAD65 (two injections of alum-formulated protein, one month apart) is also in progress in Sweden (NCT01122446). Alternatively, in the last decade many pre-clinical studies in the NOD mice have focused on the use of T1D epitopes from different autoantigens (mainly GAD65, insulin and proinsulin, HSP60). It was demonstrated that the administration of single or mixed T1D-epitopes in the range of µg (usually 40-600) can effectively prevent, delay or suppress the onset of the disease (Arai et al., 2010; Chen et al., 2009; Daniel et Wegmann, 1996; Eldor et al., 2009; Tian et al., 1996; Tisch et al., 1999; Ogino et al., 2000). A modified peptide from HSP60 (DiaPep277) was also tested in humans and two ongoing phase III trials in newly diagnosed T1D patients are assessing its efficacy in preserving β-cell function (NCT00615264 and NCT01103284). The major disadvantage connected with this kind of therapy is the high cost associated with molecule production. In the perspective of ASI therapy for autoimmune treatment the production of immunoreactive molecules in cost-effective recombinant systems would be highly desirable. For this purpose, plant-based systems represent useful platforms for the production of therapeutic proteins, offering advantages in terms of economy and scalability. The aim of this Ph.D. project is the expression of different forms of T1D candidate vaccines in several plant expression platforms, in order to develop high-throughput and cost-effective systems for the production and purification of the target molecules, to use for antigen-specific immunotherapy of T1D. Different forms of GAD65 (one of the major T1D autoantigen) were expressed in several plant-based platforms, demonstrating the feasibility of this approach to obtain high recombinant protein yields. Expression levels and molecular features of the protein obtained in the different plant systems are discussed. Moreover, exploiting the fact that plant viruses can be used as scaffold to display peptides of interest on their surface, plant-viral particles displaying a GAD65 T1D epitope were produced. The efficacy of these molecules as novel candidate vaccine for the prevention of the disease will be tested in NOD mouse animal model.

Plant platforms for the production of T1D candidate vaccines

MERLIN, Matilde
2013

Abstract

Il diabete di tipo 1 (T1D), definito anche diabete insulino-dipendente o diabete giovanile, è una malattia cronica nella quale si verifica una progressiva distruzione delle cellule β del pancreas, responsabili della produzione di insulina. La conseguente diminuzione di insulina provoca l’incremento della concentrazione di glucosio nel sangue e l’alterazione del metabolismo dei carboidrati, richiedendo una terapia sostitutiva continua che rende i pazienti totalmente dipendenti da iniezioni insuliniche. L’incidenza in Europa di questa malattia nei bambini al di sotto dei 14 anni varia tra 11 e 25 nuovi casi all’anno ogni 100 000 bambini e i dati epidemiologici indicano che è destinata ad aumentare. La distruzione selettiva delle cellule β pancreatiche è un processo immuno-mediato legato all’inefficienza dei normali meccanismi responsabili del mantenimento della tolleranza verso gli antigeni autologhi, quali l’isoforma da 65 kDa della glutammato decarbossilasi (GAD65) e l’insulina; un ruolo autoantigenico nella malattia è stato inoltre ipotizzato per la proteina heat-shock 60 (HSP60), rilasciata dalle cellule β in seguito a stress. Numerosi studi in modelli animali e in soggetti diabetici o a rischio di sviluppare la malattia, stanno testando la possibilità di prevenirne o bloccarne il decorso attraverso la somministrazione di autoantigeni o loro peptidi immunoreattivi, in grado di indurre un processo di tolleranza immunologica; tale strategia è detta immunoterapia antigene-specifica (ASI). I suoi effetti sono strettamente dipendenti dalla molecola scelta per il trattamento, dalla via di somministrazione e dallo stadio della patologia al momento dell’intervento. Questo approccio consente di eliminare o inattivare dal punto di vista funzionale le cellule T autoreattive in modo selettivo, ovvero senza compromettere la funzionalità del sistema immunitario. Sulla base dei risultati positivi ottenuti nel modello animale (topo NOD - non obeso diabetico), test clinici nell’uomo miranti a valutare l’efficacia della somministrazione di insulina per via orale (NCT00419562) o intranasale (NCT00419562) sono attualmente in corso. Inoltre uno studio in fase II basato sulla somministrazione di GAD65 si sta svolgendo in Svezia, con lo scopo di testare l’efficacia di questa molecola nella prevenzione della malattia in soggetti pre-diabetici (NCT01122446). Oltre che attraverso antigeni interi, la tolleranza immunologica può essere indotta attraverso la somministrazione di peptidi. In particolare è stato dimostrato che il trattamento di topi NOD con microgrammi di peptidi rappresentanti alcuni dei maggiori epitopi T derivanti dagli autoantiantigeni della malattia, può prevenire, ritardare o sopprimere in modo efficace il processo di patogenesi. Un peptide derivante da HSP60 (DiaPep277) è stato già testato in pazienti malati di T1D di recente insorgenza e due studi di fase III attualmente in corso, stanno valutando la sua efficacia nel preservare la funzionalità delle cellule β (NCT00615264 e NCT01103284). Fra i maggiori svantaggi di questo tipo di terapia, vi è l’alto costo associato alla produzione delle molecole di interesse. Nella prospettiva di utilizzo dell’immunoterapia a livello più ampio come strategia di vaccinazione dei soggetti a rischio, è auspicabile lo sviluppo di sistemi che consentano la produzione delle molecole a costi minori rispetto ai sistemi attualmente utilizzati. Nel corso degli ultimi venti anni numerose evidenze sperimentali dimostrano che le piante possono essere utilizzate come biofabbriche per la produzione di molecole di interesse terapeutico, offrendo vantaggi in termini economici e di scalabilità. L’obiettivo generale di questo progetto di dottorato, è la produzione di molecole utilizzabili come putativi vaccini del diabete autoimmune in diverse piattaforme vegetali, con lo scopo di sviluppare sistemi di produzione e purificazione delle molecole di interesse altamente efficienti ed economici. In particolare, diverse forme della GAD65 sono state prodotte in piattaforme vegetali di vario tipo, dimostrando l’applicabilità di questo approccio per la produzione di tale proteina. Inoltre, sfruttando il fatto che i virus vegetali possono essere utilizzati come supporto per l’esposizione di peptidi eterologhi, sono state prodotte particelle virali esponenti sulla loro superficie un epitopo della GAD65 umana, da testare nel modello animale per valutarne l’efficacia nella prevenzione della malattia.
molecular farming; Nicotiana benthamiana; Nicotiana tabacum; type 1 diabetes; Immunotherapy; transient and stable expression; recombinant proteins
Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease characterized by the T-cell mediated destruction of insulin-secreting pancreatic β-cells, causing the need of life-long insulin therapy. The autoimmune response is targeted mainly against some proteins present on the β-cells, including the smaller isoform of glutamic acid decarboxylase (GAD65), insulin and the tyrosine phosphate-like IA-2/IA-2B antigen; an autoantigenic role of heat-shock protein 60 (HSP60) released from stressed β-cells has also been demonstrated. Clinical trials are currently testing the possibility of preventing the clinical onset of the disease or delaying the loss of -cell function using immunological strategies based on the induction of tolerance (Tisch & McDevitt, 1994). In this research field, many studies have focused on antigen-specific immunotherapy (ASI), which is based on the delivery of autoantigens or autoantigen-derived peptides at different disease stages and via different routes, resulting in self-tolerance and prevention, delay or suppression of the pathogenic process. ASI is an appealing strategy in autoimmune disease treatment because it selectively inactivates, eliminates, or functionally deviates autoreactive T cells while maintaining the function of the remainder of the immune system (Tisch et al., 1999). The effect is strongly dependent on dose, frequency, route of administration, use of adjuvants, interindividual variations and especially the molecule used for immunization (autoantigen chosen, use of the whole protein or single or mixed peptides) (Peakman et von Herrath, 2010). Given the many potential advantages of this kind of therapy, several studies have been performed by the administration of whole T1D autoantigens or autoantigen peptides, aiming at preventing the disease or suppressing its pathogenic process. In particular, given the promising pre-clinical results obtained in T1D animal model (non obese diabetic -NOD- mouse), human trials based on oral (NCT00419562) and intranasal (NCT00336674) administration of whole insulin are currently underway. A phase II prevention trial based on the use of whole GAD65 (two injections of alum-formulated protein, one month apart) is also in progress in Sweden (NCT01122446). Alternatively, in the last decade many pre-clinical studies in the NOD mice have focused on the use of T1D epitopes from different autoantigens (mainly GAD65, insulin and proinsulin, HSP60). It was demonstrated that the administration of single or mixed T1D-epitopes in the range of µg (usually 40-600) can effectively prevent, delay or suppress the onset of the disease (Arai et al., 2010; Chen et al., 2009; Daniel et Wegmann, 1996; Eldor et al., 2009; Tian et al., 1996; Tisch et al., 1999; Ogino et al., 2000). A modified peptide from HSP60 (DiaPep277) was also tested in humans and two ongoing phase III trials in newly diagnosed T1D patients are assessing its efficacy in preserving β-cell function (NCT00615264 and NCT01103284). The major disadvantage connected with this kind of therapy is the high cost associated with molecule production. In the perspective of ASI therapy for autoimmune treatment the production of immunoreactive molecules in cost-effective recombinant systems would be highly desirable. For this purpose, plant-based systems represent useful platforms for the production of therapeutic proteins, offering advantages in terms of economy and scalability. The aim of this Ph.D. project is the expression of different forms of T1D candidate vaccines in several plant expression platforms, in order to develop high-throughput and cost-effective systems for the production and purification of the target molecules, to use for antigen-specific immunotherapy of T1D. Different forms of GAD65 (one of the major T1D autoantigen) were expressed in several plant-based platforms, demonstrating the feasibility of this approach to obtain high recombinant protein yields. Expression levels and molecular features of the protein obtained in the different plant systems are discussed. Moreover, exploiting the fact that plant viruses can be used as scaffold to display peptides of interest on their surface, plant-viral particles displaying a GAD65 T1D epitope were produced. The efficacy of these molecules as novel candidate vaccine for the prevention of the disease will be tested in NOD mouse animal model.
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