SCOPO: 1) valutare l’espressione della proteine che regola il trasporto del cloro transmembrana (CFTR) e la sua attività funzionale nei monociti; 2) creare delle linee cellulari immortalizzate a partire da linfociti B aventi genotipi differenti; 3) valutare linee cellulari immortalizzate. CONOSCENZE DI BASE: La Fibrosi Cistica (CF), la più commune e grave malattia autosomale diffusa nei Paesi Caucasici, è dovuta alla presenza di mutazioni sul gene CFTR. Sebbene la CF sia una malattia multi organo, la patologia polmonare è la principale causa di morte tra i pazienti CF. E’ caratterizzata da una infiammazione cronica, conseguenza di un’infezione batterica. La suscettibilità alle infezioni batteriche non è completamente conosciuta, anche se il coinvolgimento di CFTR nelle funzioni microbicide dei macrofagi sta emergendo in questo periodo. I macrofagi differenziano in situ a partire dai monociti infiltati nel tessuto e mostrano una marcata variabilità morfologica pur avendo comuni funzioni cellulari e molecolari. Sebbene l’espressione di CFTR nei macrofagi alveolari sia stata descritta, la sua espressione nei monociti non è ancora stata riportata anche se queste cellule risultano essere più accessibili per studi funzionali e di espressione. La valutazione dell’espressione e della funzione del CFTR nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è un pre-requisito per valutare il loro ruolo ed il loro potenziale utilizzo in diagnostica e nello sviluppo di nuovi farmaci con azione sul difetto molecolare del CFTR. METODI: Purificazione dei monociti e dei linfociti B da sangue intero; produzione del virus Epstein-Barr (EBV); immortalizzazione dei linfociti B mediante EBV; isolamento RNA e analisi dell’mRNA mediante PCR; Real-time PCR; Western blotting; citometria di flusso; immunofluorescenza; depolarizzazione di membrana; misurazione delle differenze dei potenziali nasali; analisi dei dati. RISULTATI: Utilizzando un anticorpo anti-CFTR policlonale e due monoclonali che riconoscono differenti epitopi, abbiamo rilevato mediante western blotting tutte le forme conosciute del CFTR. La citometria di flusso e la microscopia confocale ha confermato l’espressione di CFTR e la sua localizzazione su membrana. Abbiamo osservato che i monociti non-CF, dopo stimolazione con uno specifico agonista di CFTR, mostravano un aumento dell’intensità di fluorescenza, una variazione che non abbiamo rilevato nei monociti CF. Questi risultati hanno suggerito una correlazione dell’attività di CFTR con la depolarizzazione della membrana ed i dati sono stati confermati tramite uno specifico inibitore, CFTR (inh)-172. Questo approccio è stato comparato alla misurazione dei potenziali nasali (NPD) eseguiti sugli stessi soggetti ed la sovrapposizione dei dati ha rilevato una forte corrispondenza tra le due tecniche. I linfociti B sono stati immortalizzati mediante EBV e sono stati utilizzati come potenziali modelli cellulari per valutare l’attività del CFTR. Abbiamo rilevato la maggiore forma glicosilata di CFTR in queste linee immortalizzate utilizzando un anticorpo monoclonale anti-CFTR. Una forma a minore peso molecolare è stata anch’essa evidenziata mediante questo anticorpo ed uno policlonale. La citometria di flusso e la microscopia confocale ci hanno permesso di confermare l’espressione e la localizzazione su membrana del CFTR. Il test di depolarizzazione della membrana è stato applicato sulle cellule B immortalizzate ottenendo gli stessi risultati visti sui monociti. CONCLUSIONI: Abbiamo dimostrato l’espressione della proteina CFTR in monociti umani identificando una variante a peso molecolare corrispondente ad un basso livello di post-trasduzione della proteina. Questo è stato confermato utilizzando monociti con genotipo omozigote per la mutazione non-sense i quali perdevano l’espressione della forma di CFTR. La citometria di flusso potrebbe essere utile per valutare l’espressione di CFTR. Infatti abbiamo dimostrato che può distinguere tra non-CF ed eterozigoti da pazienti CF mediante la marcatura CD14/Rb-AF488 dei monociti. L’analisi della depolarizzazione di membrana su singola cellula ha confermato l’espressione funzionale del CFTR mostrando una elevata depolarizzazione di membrana a seguito della stimolazione delle cellule con uno specifico agonista del CFTR. Questo metodo potrebbe essere eseguito entro un paio di ore dal prelievo del sangue. Inoltre, è facilmente riproducibile con un minimo disturbo e rischio per il paziente e potrebbe permettere una valutazione in corso d’opera degli effetti di alcune particolari terapie sull’espressione e sull’attività del CFTR. Abbiamo creato uno specifico indice capace di discriminare tra CF e non-CF. La sovrapposizione dei dati NPD e di quelli sull’attività funzionale del CFTR sui monociti risultata in una perfetta corrispondenza tra le due tecniche. Poiché NPD è un test diagnostico che si applica su soggetti con test del sudore dubbio o con almeno una mutazione non conosciuta, possiamo promuovere la valutazione dell’attività del CFTR nei monociti mediante tecniche ottiche come un utile metodo per valutare l’attività di CFTR per la ricerca, includendo lo sviluppo di nuovi farmaci e la diagnosi. Dato che le cellule primarie hanno disponibilità limitata in termini quantitativi, abbiamo preso vantaggio dall’osservazione che i linfociti esprimono CFTR. Le cellule B immortalizzate potrebbero essere utilizzate come modello cellulare per studiare l’espressione e l’attività del CFTR. Abbiamo rilevato l’espressione di una forma di CFTR che probabilmente rappresenta una isoforma processata a seguito dell’attività di una specifica calpaina nei linfociti come dimostrato in letteratura. Inoltre, l’indice ottenuto mediante lo studio della depolarizzazione di membrana ci ha permesso di discriminare tra gruppi CF e non-CF come osservato nei monociti. Tutti questi risultati hanno dimostrato che il CFTR è espresso ed è attivo nei linfociti umani e nelle cellule B immortalizzate. Per tale motivo, queste cellule possono essere sfruttate per valutare la risposta di specifiche mutazioni a nuovi farmaci diretti o indiretti sul difetto di base di CF.

AIM: 1) to evaluate the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein expression and functional activity in monocytes; 2) to create immortalized cell lines from human B-lymphocyte cells characterized by different genotypes; 3) to evaluate CFTR protein expression in immortalized B cells. BACKGROUND: Cystic Fibrosis (CF), the most common autosomal severe disorder in Caucasians, is caused by mutations in the CFTR gene. Although CF is a multi-organ disease, the lung pathology is the main cause of morbidity and mortality of CF patients. It is characterized by chronic inflammation as a consequence of persistent bacterial infections by several opportunistic pathogens. Mechanisms leading to increased susceptibility to bacterial infections in CF are not completely known, although the involvement of CFTR in microbicidal functions of macrophages is emerging. Tissue macrophages differentiate in situ from infiltrating monocytes and display a remarkable variability in cell morphology although common molecular and cellular functions. Although expression of CFTR in alveolar macrophages has been described, its expression has not been reported in monocytes that are more accessible for expression studies and functional analysis tests than macrophages. Evaluation of expression and functional activity of CFTR in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is a pre-requisite to evaluate their role and their potential use in diagnostic and developing new drugs acting on the molecular defect of CF. METHODS: Purification of monocytes and lymphocyte B cells from whole blood; production of Epstein-Barr Virus (EBV); immortalization of Lymphocytes B cells by EBV; RNA isolation and CFTR mRNA analysis by reverse-transcription and polymerase chain reaction (PCR); quantitative real-time PCR (RT-qPCR); western Blotting; Flow cytometry assay; immunofluorescence; cell depolarization assay; Nasal Potential Differences (NPDs) assay; analysis of cell depolarization assay data. RESULTS: In this study western blotting using a polyclonal and two monoclonal anti-CFTR antibodies that recognize different epitopes detected all known forms of CFTR. Flow cytometry and confocal microscopy analysis confirmed expression of CFTR protein expression and its membrane localization. Increased fluorescence intensity, corresponding to membrane depolarization, was observed only when non-CF monocytes were stimulated with CFTR agonist, while CF monocytes did not show fluorescence variation. These results suggested a correlation between CFTR activity and membrane depolarization and data were confirmed using a specific CFTR inhibitor, CFTR (inh)-172. This approach was compared to NPD measurements performed in a subset of the same patients subjected to this analysis. Results obtained by NPD overlapped those obtained by the analysis of monocytes from non-CF donors and CF patients. B-lymphocytes were then immortalized by EBV and were tested as potential cell models for CFTR activity assays. The major glycosylated form of CFTR was detected in immortalized non-CF EVB-transformed B cell line by a monoclonal anti-CFTR antibody, but a band with minor molecular weight was also detected with this antibody and with a polyclonal anti-CFTR antibody. Flow cytometry and confocal assay allowed us to confirm CFTR expression and membrane location in these cell lines. Membrane depolarization test was applied in EBV-transformed B cells and the results confirmed a stimulus induced membrane depolarization in non- CF cells. CONCLUSION: We have demonstrated that CFTR proteins are expressed in human monocytes as a variant recognized by a specific antibody. Its molecular weight is consistent with a lower level of post-translational processing and its loss in patients carrying a homozygous non-sense mutation confirmed its presence in human monocytes. Flow cytometry could be also a useful method to evaluate CFTR expression. We demonstrated that it can distinguish between non-CF and HTZ subjects and CF patients analyzing stained CD14/Rb-AF488 monocytes. Single-cell membrane depolarization analysis confirmed that, upon stimulation with CFTR agonists, normal monocytes displayed a highly reproducible membrane depolarization activity consistent with the expression of functional CFTR. Single-cell depolarization assay could be performed within a few hours after blood collection. It is also easily repeatable with a minimal discomfort and risk for the patient and it could thus allow a time-course evaluation of effects of any particular therapy on CFTR expression or functional activity. A specific activity index was devised that appears capable to discriminate among CF and non-CF cells. Overlapping NPD data and functional activity data, we observed a perfect correspondence. Since NPD is a reference diagnostic test applied when a subject has borderline sweat test and at least one unidentified CFTR mutation, we might promote the evaluation of CFTR activity in monocytes by optical techniques as a useful tool to assess CFTR activity for basic and translational research, including drug development and diagnosis. As primary cells are available in limited amounts, we have taken advantage of the observation that CFTR-associated Cl- permeability has been demonstrated in lymphocytes. So, immortalized-B-cells could be useful as cellular model to study CFTR expression and activity. We observed a form of CFTR that likely represents a processed isoform possibly linked to specific calpain activity in lymphocyte cells as demonstrated in the literature. Furthermore, the index obtained by single-cell fluorescence imaging discriminated between non-CF and CF groups as shown in monocytes. All these results demonstrated that CFTR protein is expressed and is active in human lymphocytes and EBV-transformed B cells opening interesting perspectives in this field. Indeed, these cells can be exploited to evaluate the response of specific mutations to newly developed drugs acting directly or indirectly on the basic defect of CF.

CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR (CFTR) IN HUMAN LEUKOCYTES

VERZE', Genny
2013

Abstract

SCOPO: 1) valutare l’espressione della proteine che regola il trasporto del cloro transmembrana (CFTR) e la sua attività funzionale nei monociti; 2) creare delle linee cellulari immortalizzate a partire da linfociti B aventi genotipi differenti; 3) valutare linee cellulari immortalizzate. CONOSCENZE DI BASE: La Fibrosi Cistica (CF), la più commune e grave malattia autosomale diffusa nei Paesi Caucasici, è dovuta alla presenza di mutazioni sul gene CFTR. Sebbene la CF sia una malattia multi organo, la patologia polmonare è la principale causa di morte tra i pazienti CF. E’ caratterizzata da una infiammazione cronica, conseguenza di un’infezione batterica. La suscettibilità alle infezioni batteriche non è completamente conosciuta, anche se il coinvolgimento di CFTR nelle funzioni microbicide dei macrofagi sta emergendo in questo periodo. I macrofagi differenziano in situ a partire dai monociti infiltati nel tessuto e mostrano una marcata variabilità morfologica pur avendo comuni funzioni cellulari e molecolari. Sebbene l’espressione di CFTR nei macrofagi alveolari sia stata descritta, la sua espressione nei monociti non è ancora stata riportata anche se queste cellule risultano essere più accessibili per studi funzionali e di espressione. La valutazione dell’espressione e della funzione del CFTR nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è un pre-requisito per valutare il loro ruolo ed il loro potenziale utilizzo in diagnostica e nello sviluppo di nuovi farmaci con azione sul difetto molecolare del CFTR. METODI: Purificazione dei monociti e dei linfociti B da sangue intero; produzione del virus Epstein-Barr (EBV); immortalizzazione dei linfociti B mediante EBV; isolamento RNA e analisi dell’mRNA mediante PCR; Real-time PCR; Western blotting; citometria di flusso; immunofluorescenza; depolarizzazione di membrana; misurazione delle differenze dei potenziali nasali; analisi dei dati. RISULTATI: Utilizzando un anticorpo anti-CFTR policlonale e due monoclonali che riconoscono differenti epitopi, abbiamo rilevato mediante western blotting tutte le forme conosciute del CFTR. La citometria di flusso e la microscopia confocale ha confermato l’espressione di CFTR e la sua localizzazione su membrana. Abbiamo osservato che i monociti non-CF, dopo stimolazione con uno specifico agonista di CFTR, mostravano un aumento dell’intensità di fluorescenza, una variazione che non abbiamo rilevato nei monociti CF. Questi risultati hanno suggerito una correlazione dell’attività di CFTR con la depolarizzazione della membrana ed i dati sono stati confermati tramite uno specifico inibitore, CFTR (inh)-172. Questo approccio è stato comparato alla misurazione dei potenziali nasali (NPD) eseguiti sugli stessi soggetti ed la sovrapposizione dei dati ha rilevato una forte corrispondenza tra le due tecniche. I linfociti B sono stati immortalizzati mediante EBV e sono stati utilizzati come potenziali modelli cellulari per valutare l’attività del CFTR. Abbiamo rilevato la maggiore forma glicosilata di CFTR in queste linee immortalizzate utilizzando un anticorpo monoclonale anti-CFTR. Una forma a minore peso molecolare è stata anch’essa evidenziata mediante questo anticorpo ed uno policlonale. La citometria di flusso e la microscopia confocale ci hanno permesso di confermare l’espressione e la localizzazione su membrana del CFTR. Il test di depolarizzazione della membrana è stato applicato sulle cellule B immortalizzate ottenendo gli stessi risultati visti sui monociti. CONCLUSIONI: Abbiamo dimostrato l’espressione della proteina CFTR in monociti umani identificando una variante a peso molecolare corrispondente ad un basso livello di post-trasduzione della proteina. Questo è stato confermato utilizzando monociti con genotipo omozigote per la mutazione non-sense i quali perdevano l’espressione della forma di CFTR. La citometria di flusso potrebbe essere utile per valutare l’espressione di CFTR. Infatti abbiamo dimostrato che può distinguere tra non-CF ed eterozigoti da pazienti CF mediante la marcatura CD14/Rb-AF488 dei monociti. L’analisi della depolarizzazione di membrana su singola cellula ha confermato l’espressione funzionale del CFTR mostrando una elevata depolarizzazione di membrana a seguito della stimolazione delle cellule con uno specifico agonista del CFTR. Questo metodo potrebbe essere eseguito entro un paio di ore dal prelievo del sangue. Inoltre, è facilmente riproducibile con un minimo disturbo e rischio per il paziente e potrebbe permettere una valutazione in corso d’opera degli effetti di alcune particolari terapie sull’espressione e sull’attività del CFTR. Abbiamo creato uno specifico indice capace di discriminare tra CF e non-CF. La sovrapposizione dei dati NPD e di quelli sull’attività funzionale del CFTR sui monociti risultata in una perfetta corrispondenza tra le due tecniche. Poiché NPD è un test diagnostico che si applica su soggetti con test del sudore dubbio o con almeno una mutazione non conosciuta, possiamo promuovere la valutazione dell’attività del CFTR nei monociti mediante tecniche ottiche come un utile metodo per valutare l’attività di CFTR per la ricerca, includendo lo sviluppo di nuovi farmaci e la diagnosi. Dato che le cellule primarie hanno disponibilità limitata in termini quantitativi, abbiamo preso vantaggio dall’osservazione che i linfociti esprimono CFTR. Le cellule B immortalizzate potrebbero essere utilizzate come modello cellulare per studiare l’espressione e l’attività del CFTR. Abbiamo rilevato l’espressione di una forma di CFTR che probabilmente rappresenta una isoforma processata a seguito dell’attività di una specifica calpaina nei linfociti come dimostrato in letteratura. Inoltre, l’indice ottenuto mediante lo studio della depolarizzazione di membrana ci ha permesso di discriminare tra gruppi CF e non-CF come osservato nei monociti. Tutti questi risultati hanno dimostrato che il CFTR è espresso ed è attivo nei linfociti umani e nelle cellule B immortalizzate. Per tale motivo, queste cellule possono essere sfruttate per valutare la risposta di specifiche mutazioni a nuovi farmaci diretti o indiretti sul difetto di base di CF.
Cystic Fibrosis; Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; Monocytes; Human B Lymphocytes; Nasal Potential Difference Measuraments; Single-cell membrane depolarization assay; Eptein-Barr virus
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