Identification of Novel Cytoprotective Systems in Normal and Pathological Erythropoiesis

Le anemie sono malattie diffuse in tutto il mondo e compaiono in tutte le fasce di età, sulla base della presentazione clinica e delle loro caratteristiche fisiopatologiche, e possono essere suddivise in forme di tipo ereditario o acquisito. Le anemie si definiscono sulla base del riscontro di ridotti livelli di emoglobina che possono essere correlati sia alla perturbazione della maturazione dei precursori eritroidi che alla riduzione della sopravvivenza in circolo dei globuli rossi maturi. Nonostante i progressi compiuti nella caratterizzazione molecolare dell’eritropoiesi, i meccanismi coinvolti negli eventi di maturazione delle cellule eritroidi normali e patologiche sono ancora poco conosciuti. La ß-talassemia è un modello di eritropoiesi patologica. E’ una malattia ereditaria del globulo rosso dovuta a una mutazione nel gene della catena ß dell’emoglobina che causa uno sbilanciamento del rapporto di sintesi tra le catene globiniche α/ß, che in presenza di ferro ed eme libero, si associa ad un aumento di danno ossidativo da radicali liberi d'ossigeno (ROS). Il ruolo dei ROS nell’eritropoiesi ß-talassemica è ancora oggetto di studio. Nel presente lavoro sono stati condotti due studi diretti a valutare l’impatto dello stress ossidativo nella ß-talassemia, utilizzata come modello di eritropoiesi patologica. Abbiamo identificato due nuovi sistemi citoprotettivi importanti nella risposta dell'eritropoiesi allo stress ossidativo (Parte 1) ed è stato valutato l’effetto del resveratrolo, una molecola antiossidante, sull'anemia correlata alla ß-talassemia (Parte 2). Parte 1. Abbiamo studiato l’eritropoiesi in vitro usando cellule periferiche CD34+ da soggetti normali o con ß-talassemia intermedia. E’ stato dimostrato che, nelle cellule eritroidi di ß-talassemia, c’è un aumento dei livelli di ROS insieme ad un aumento di eme libero nelle fasi precoci dell’eritropoiesi. In risposta allo stress ossidativo, nelle cellule ß-talassemiche, abbiamo osservato un’inibizione dell’attività di ALAS-2, un enzima chiave della via biosintetica dell'eme. Questa inibizione risulta nella riduzione dei livelli di eme, dimostrando il ruolo di ALAS-2 come meccanismo citoprotettivo contro il danno ossidativo nell’eritropoiesi ß-talassemica. Successivamente abbiamo dimostrato che perossiredossina 2, un enzima antiossidante, è up-regolato come risposta allo stress ossidativo in ß-talassemia. Il silenziamento della perossiredossina 2 in cellule K562, una linea cellulare eritroide, ci permetteva di osservare un aumento della suscettibilità di tali cellule all'H2O2. La capacità di perossiredossina 2 di legare eme libero supporta il suo ruolo protettivo nell’eritropoiesi. Concludendo, abbiamo dimostrato l’importanza funzionale di due nuovi sistemi citoprotettivi nell’eritropoiesi ß-talassemica: ALAS-2 e perossiredossina 2. Parte 2. Abbiamo valutato l’effetto di basse dosi di resveratrolo in un modello in vitro di eritropoiesi ß-talassemica. Abbiamo osservato come il resveratrolo acceleri la maturazione eritroide con accumulo di cellule in fase S del ciclo cellulare e up-regoli l’espressione genica di p21. In cellule purificate di CFU-E, abbiamo documentato come il resveratrolo inibisca Akt, attivi FoxO3a con up-regolazione di sistemi antiossidanti, come catalasi e perossiredossina 2. Abbiamo quindi valutato l’attivazione di FoxO3 da parte di resveratrolo in un modello murino di ß-talassemia. In vivo il resveratrolo (2.4 mg/Kg) migliora l’eritropoiesi inefficace dei topi ß-talassemici, inducendo l’aumento dei livelli di emoglobina, riduzione del numero di reticulociti, aumento della sopravivenza dei globuli rossi e riduzione del danno ossidativo della membrana del globulo rosso. Nei topi wild-type e ß-talassemici, il resveratrolo induce l’espressione di enzime di scavengers (catalasi e perossiredossina 2). Concludendo, abbiamo dimostrato che resveratrolo inibisce Akt, con conseguente attivazione di FoxO3, un modulatore di sistemi citoprotettori, permettendo ai precursori eritroidi ß-talassemici di resistere allo stress ossidativo e di continuare a differenziarsi. Gli effetti di resveratrolo nell’eritropoiesi insieme al miglioramento dello stress ossidativo nei globuli rossi ha permesso di validare l’uso del resveratrolo come possibile agente terapeutico nella ß-talassemia.

Anemias are a world-wide distributed disease, affecting people of all ages and can be either hereditary or acquired. Anemias are characterized by reduction in hemoglobin levels which can be related to perturbation of either erythroid maturation and/or reduced red cell survival. In spite of the progress made in the molecular characterization of normal erythropoiesis, much still need to be investigated about the mechanism involved in maturation events in normal and pathological erythropoiesis. ß-thalassemia is a model of pathological erythropoiesis and is an inherited red cell disorder due to a mutation on ß-globin chain. This resuls in α/ß globin chains unbalance and high levels of reactive oxygen species (ROS) generated by pathological free heme/iron. The role of ROS in ß-thalassemic erythropoiesis is still under investigation. Here we carried out two studies to analyze the impact of oxidative stress in pathological erythropoiesis. We identified two novel cytoprotective systems (PART 1) and we evaluate the effects of resveratrol, as an antioxidant agent, in ß-thalassemic anemia (PART 2). PART 1. We studied in vitro erythropoiesis using peripheral CD34+ cells from normal and ß-thalassemia-intermedia subjects. We demonstrated that ROS levels were higher in ß-thalassemic erythroid cells and associated with increased heme levels in early erythropoiesis. In response to oxidative stress in ß-thalassemic cells we observed the inhibition of ALAS-2 activity, a key enzyme of the heme-biosynthetic pathway. This results in the reduction of heme levels, supporting the role of ALAS-2 as a cytoprotective mechanism against ROS in ß-thalassemic erythropoiesis. Then we showed that peroxiredoxin-2, an antioxidant enzyme, is up-regulated in response to oxidative stress in ß-thalassemia. The silencing of peroxiredoxin 2 in K562, an erythroid cell line, was associated with increased cell susceptibility to H2O2. The protective role of peroxiredoxin 2 in erythropoiesis was also supported by its ability to bind free heme. In conclusion, we demonstrate the functional relevance of two novel cytoprotective systems in ß-thalassemic erythropoiesis: ALAS-2 and peroxiredoxin 2. PART 2. We evaluated the effects of low-dose resveratrol on in vitro model of ß-thalassemic erythropoiesis. We found that resveratrol accelerates erythroid maturation with accumulation of cells in S-phase of the cell cycle together with up-regulation of p21 gene expression. In isolated CFU-E cells, resveratrol induces Akt inhibition, activation of FoxO3a with related up-regulation of antioxidant systems, such as catalase and peroxiredoxin 2. We then validated the resveratrol-induced FoxO3 activation in a mouse model for ß-thalassemia. Resveratrol supplementation (2.4 mg/Kg) ameliorated ineffective erythropoiesis of ß-thalassemic mice, with increase of Hb levels, reduction of reticulocyte count, increase of red cell survival, and reduction of red cell membrane oxidative damage. In both wt and ß-thalassemic mice resveratrol up-regulated scavenging enzymes (catalase and peroxiredoxin 2). In conclusion, we show that resveratrol inhibits Akt, resulting in FoxO3 activation, with modulation of cytoprotective systems, enabling the ß-thal erythroid precursors to resist the oxidative damage and continue to differentiate. The effects of resveratrol on erythropoiesis combined with an amelioration of oxidative stress in circulating red cells validate the use of resveratrol as a possible therapeutic agent in ß-thalassemia.